桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白與口蹄疫病毒VP1蛋白及其免疫原性的研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是一種豬源性疾病，可以破壞5～12周齡仔豬的免疫系統(tǒng)，使其相繼因營養(yǎng)缺失或多種并發(fā)癥而導(dǎo)致死亡。豬等偶蹄目動物在自然狀態(tài)下感染口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)后，經(jīng)常表現(xiàn)出的病理狀態(tài)為唇、蹄部皮膚發(fā)生糜爛并多伴有大量水泡生成，使其進(jìn)食困難，阻礙其生長。目前這兩種疾病都對中國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害，現(xiàn)如今對豬進(jìn)行疫

2、苗免疫是中國普遍通用的預(yù)防手段。但是，針對這兩種動物疫病的傳統(tǒng)疫苗仍存在很多不足和需要改進(jìn)的方面，因此仍需依靠基因工程等方法研制出新型的動物疫苗來控制這兩種疾病的傳播。
　　PCV2Cap蛋白是PCV2的主要結(jié)構(gòu)性蛋白，能介導(dǎo)病毒的識別和入侵，這種分布在病毒表面的蛋白質(zhì)與病毒的病原性息息相關(guān)。而VP1蛋白是FMDV的主要結(jié)構(gòu)性蛋白，這種蛋白對FMDV的血清型差異以及免疫原性的隔離都有著關(guān)鍵性的影響，同時能夠被宿主細(xì)胞表面的受體識別

3、并與之結(jié)合。因此，Cap和VP1通常被作為針對PCV2和FMDV基因工程疫苗的關(guān)鍵性靶蛋白。目前，已有多篇研究表明CD40配體(CD40Ligand，CD40L)可以作為分子佐劑增強(qiáng)疫苗的免疫效果。因此，豬CD40L可以成為增強(qiáng)這兩種疾病疫苗的分子佐劑，提高其免疫效果。
　　本研究將Cap和VP1這兩種蛋白與豬CD40L進(jìn)行融合表達(dá)并利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將融合蛋白展示在桿狀病毒表面，構(gòu)建了3種重組桿狀病毒:rvAc-Cap、rv

4、Ac-VP1和rvAc-Cap-VP1。通過SDS-PAGE電泳分析和Western blotting檢測這3種重組桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞證明3種融合蛋白成功表達(dá)，大小分別約為146kDa、138kDa和165kDa，符合預(yù)期理論值。并通過間接免疫熒光和免疫電鏡驗證了融合蛋白成功展示在了被感染細(xì)胞的細(xì)胞膜表面和重組桿狀病毒的囊膜表面。以1×108pfu/只的劑量用純化的重組桿狀病毒顆粒作為活載體疫苗對BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫接種，

5、通過間接ELISA檢測小鼠血清中Cap和VP1的抗體濃度，證明表面展示有Cap和VP1的重組桿狀病毒能激發(fā)小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平，與PCV2和FMDV商品化疫苗免疫組的抗體濃度差異不顯著(P＞0.05)，檢測小鼠血清中IL-4的濃度，證明重組桿狀病毒能夠刺激小鼠的IL-4分泌水平升高。為了進(jìn)一步探究其免疫效果，將rvAc-Cap-VP1以1×108pfu/只的劑量通過霧化免疫的方法免疫小鼠，間接ELISA檢測表明小鼠血清中Cap和VP1

6、的抗體濃度與PBS組相比顯著升高(P＜0.05)，rvAc-Cap-VP1霧化免疫組的IL-4分泌水平升高。
　　上述實驗結(jié)果表明，表面展示有Cap蛋白和VP1蛋白的rvAc-Cap-VP1重組桿狀病毒通過皮下注射免疫和霧化免疫均能夠激發(fā)小鼠產(chǎn)生PCV2和FMDV的體液免疫應(yīng)答以及細(xì)胞免疫應(yīng)答，擁有良好的免疫原性。
　　本研究將Cap和VP1展示在桿狀病毒表面，并初步探索了rvAc-Cap-VP1重組桿狀病毒在小鼠機(jī)體上的免