幽門螺桿菌與肝癌相關(guān)性及其分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：研究原發(fā)性肝癌的發(fā)生與幽門螺桿菌(H.pylori，Hp)感染的相關(guān)性，并初步探討其分子機(jī)制機(jī)制。 方法： 第一部分 1、PCR和測(cè)序分析檢測(cè)肝組織幽門螺桿菌：對(duì)80例原發(fā)性肝癌行手術(shù)切除的患者，取其肝癌組織和癌旁組織標(biāo)本，用DNAzol提取組織DNA，采用巢式PCR方法，擴(kuò)增螺桿菌屬特異的16SrRNA基因，30例正常肝組織為對(duì)照組。對(duì)螺桿菌16SrRNA基因擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與來(lái)自GenBank中的

2、其它種屬螺桿菌序列進(jìn)行同源性比較，進(jìn)一步以H.pylori(基因號(hào)AF302106)相應(yīng)序列為基礎(chǔ)，用BioEdit軟件對(duì)所擴(kuò)增的DNA序列進(jìn)行比較分析。繼而取巢式PCR擴(kuò)增陽(yáng)性，來(lái)源于不同患者的癌組織或癌旁組織的標(biāo)本DNA，PCR擴(kuò)增幽門螺桿菌特異26Kda蛋白基因和4個(gè)相關(guān)功能基因(cagA、vacA、rps4、glmM)，以進(jìn)一步確定檢出的細(xì)菌為幽門螺桿菌。2、免疫組化技術(shù)檢測(cè)肝組織幽門螺桿菌：以兔抗幽門螺桿菌抗體，通過(guò)免疫組化技

3、術(shù)，檢測(cè)80對(duì)肝癌及癌旁組織標(biāo)本。 第二部分 1、幽門螺桿菌對(duì)Hep62肝細(xì)胞增殖的影響：采用不同量的幽門螺桿菌(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637)作用于HepG2肝細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況并確定最佳的幽門螺桿菌作用劑量。2、應(yīng)用Affymetrix人類基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)幽門螺桿菌對(duì)HepG2細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，并應(yīng)用RT-PCR半定量技術(shù)驗(yàn)證部分基因芯片的檢測(cè)結(jié)果。 第三部分 1、幽門螺桿菌感染與原發(fā)性肝細(xì)胞

4、癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。2、免疫組化技術(shù)檢測(cè)Transgelin在高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移肝癌組織中的表達(dá)差異；3、免疫組化技術(shù)檢測(cè)整合素(integrin)在高轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移肝癌組織中的表達(dá)差異。 結(jié)果： 第一部分 80例肝癌患者中有57例在癌組織和/或癌旁組織中檢出螺桿菌基因，檢出率為71.25％。39份癌組織標(biāo)本檢出螺桿菌基因，陽(yáng)性率為48.75％， 38份癌旁組織標(biāo)本檢出螺桿菌基因，陽(yáng)性率為47.5％。正常肝組未檢出螺桿菌基因。

5、與癌組織和癌旁組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。對(duì)57位螺桿菌16S rRNA基因陽(yáng)性患者的基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示與H.pyIori同源性最高，均超過(guò)99％；同時(shí)對(duì)此57份標(biāo)本DNA進(jìn)行幽門螺桿菌特異基因的擴(kuò)增，結(jié)果顯示能檢出5種幽門螺桿菌基因中致少1種的共有48份，檢出率84.21％。26KDa基因陽(yáng)性率77.19％(44/57)，cagA基因陽(yáng)性率21.05％(12/57)，glmM基因陽(yáng)性率17.5％(10/57)

6、：多次擴(kuò)增均未檢出vacA基因和rps4基因。這些結(jié)果證實(shí)檢測(cè)出的螺桿菌為幽門螺桿菌。免疫組化結(jié)果顯示：80例肝癌患者中有39例在癌組織和/或癌旁組織中觀察到了彎曲狀或桿狀的幽門螺桿菌存在，檢出率為48.75％。癌組織標(biāo)本免疫組化陽(yáng)性率為32.5％，癌旁組織標(biāo)本陽(yáng)性率為30.0％。正常肝組織中未觀察到了幽門螺桿菌的存在，與癌組織和癌旁組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(0.01)。免疫組化陽(yáng)性的標(biāo)本PCR結(jié)果全陽(yáng)性。細(xì)菌主要位于肝竇內(nèi)，亦有些位于

7、匯管區(qū)內(nèi)。 第二部分 MOI比值(細(xì)菌與細(xì)胞的個(gè)數(shù)比)在0.15:1～0.075:1時(shí)，幽門螺桿菌對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的促增殖作用。表達(dá)譜基因芯片結(jié)果提示，HepG2細(xì)胞經(jīng)-定濃度(MOI比值為0.15:1)幽門螺桿菌處理后35個(gè)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化(上調(diào)19個(gè)，下調(diào)16個(gè))，其中與細(xì)胞骨架/基質(zhì)有關(guān)的基因6個(gè)，DNA結(jié)合蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子8個(gè)、細(xì)胞因子2個(gè)。選定其中的5個(gè)基因采用RT-PCR法檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)，與表達(dá)譜芯片檢測(cè)

8、結(jié)果完全吻合。 第三部分高侵襲性組原發(fā)性肝細(xì)胞癌的幽門螺桿菌16s rRNA陽(yáng)性率顯著高于低侵襲性組(分別為86.44％和58.06，P<0.01)。免疫組織化學(xué)結(jié)果提示幽門螺桿菌16s rRNA陽(yáng)性的原發(fā)性肝癌標(biāo)本中Transgelin及Integrin α2的表達(dá)水平均顯著高于16s rRNA陰性標(biāo)本。 結(jié)論： 1、肝癌組織內(nèi)存在幽門螺桿菌，幽門螺桿菌的感染與原發(fā)性肝癌可能存在某種相關(guān)性。 2、一定劑