乙肝表面抗原基因轉(zhuǎn)化香蕉及香蕉原生質(zhì)體分離的研究.pdf

1、本研究以未成熟香蕉雄花為外植體，通過誘導愈傷組織作為香蕉遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。將含有乙肝表面抗原(HBsAg)基因的植物表達載體pHBS1301(含GUS基因)，通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)入香蕉。 外植體褐化成為單子葉植物和木本植物再生體系建立時一個倍受關(guān)注的問題(Khatrieta1.，1997)。香蕉在進行遺傳轉(zhuǎn)化過程中，外植體容易褐化，從而降低了再生頻率，影響到遺傳轉(zhuǎn)化的效率。為降低香蕉轉(zhuǎn)化過程中外植體的褐化率，我們采用香蕉(M

2、usaAAAgroupcv.Brazilian)未成熟雄花作為外植體，以農(nóng)桿菌介導法進行遺傳轉(zhuǎn)化。通過調(diào)整培養(yǎng)基中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮的比例，來抑制外植體褐化。結(jié)果表明，當改良的MS培養(yǎng)基中銨態(tài)氮與硝態(tài)氮(NH+/NO-3)的摩爾比為20.6:67.6時，具有較強的抗褐化能力。當6-BA濃度為1.0mg/L時，外植體易于誘導出胚狀體。 通過根癌農(nóng)桿菌侵染香蕉愈傷組織外植體，以GUS瞬時表達效率為指標，系統(tǒng)研究了浸染時間、共培養(yǎng)條件、A

3、S濃度、篩選條件等對轉(zhuǎn)化率的影響的基礎(chǔ)上建立、優(yōu)化了以香蕉未成熟雄花為材料的香蕉遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明活化后農(nóng)桿菌稀釋后濃度為OD6000.2，侵染15min；農(nóng)桿菌侵染后暗光下共培養(yǎng)5d；在共培養(yǎng)基中加入120umol/L的AS，可明顯提高GUS瞬時表達率。共培養(yǎng)后的外植體，經(jīng)過脫菌培養(yǎng)，再經(jīng)過約6-8個月的時間誘導胚狀體及側(cè)芽，接著生根培養(yǎng)通過潮霉素加壓篩選。以適合香蕉生根的選擇壓，選擇10mg/L的潮霉素濃度作為轉(zhuǎn)基因植株生根選擇

4、壓力。得到轉(zhuǎn)p1301HBS的香蕉株系，經(jīng)提取轉(zhuǎn)化香蕉植株葉片的總DNA進行PCR驗證，初步證明目的基因已整合到香蕉的基因組中。ELISA檢測結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因香蕉葉片中表達的HBsAg具有免疫活性，測得其平均表達量為25ng/g鮮重。 以巴西香蕉(MusaAAAgroupcv.Brazilian)和皇帝蕉(MusaparadisiacalAA)胚性愈傷組織為材料，對影響其原生質(zhì)體產(chǎn)率和活力的因素進行了研究。結(jié)果表明：對誘導巴西蕉