原生質(zhì)體的分離與融合

1、原生質(zhì)體的分離與融合,,什么是原生質(zhì)體,原生質(zhì)體，是指出去細(xì)胞壁的植物細(xì)胞的部分。由Hanstein 1980年提出在適當(dāng)條件下，原生質(zhì)體可以成功培養(yǎng)長(zhǎng)出細(xì)胞壁，并通過細(xì)胞分裂。原生質(zhì)體不僅對(duì)細(xì)胞融合研究有價(jià)值，且能通過裸露的質(zhì)膜獲得外源DNA、細(xì)胞器、細(xì)菌和病毒顆粒等。,一、原生質(zhì)體分離,原生質(zhì)體分離的基本原則是 保證原生質(zhì)體不受傷害并不損害其再生能力。1. 機(jī)械法 只有儲(chǔ)藏組織中較大的、

2、高度液泡化的細(xì)胞才能用于分離原生質(zhì)體，如洋蔥球莖鱗片、蘿卜根、甜菜根等； 缺點(diǎn)：產(chǎn)量低；方法枯燥無力；因破碎細(xì)胞釋放物的存在，原生質(zhì)體活力低。2. 酶法 Cocking 在1960年證實(shí)了可用酶分離原生質(zhì)體。Takabe等1968年首次用商業(yè)酶試劑分離原生質(zhì)體，并在1971年獲得再生植株。缺點(diǎn)是：不純酶制劑所含的雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生不同程度的毒害作用。,原生質(zhì)體的分離,二、影響原生質(zhì)體分離的

3、因素,原生質(zhì)體分離時(shí)主要考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間、溫度等。1 組織和細(xì)胞材料的生理狀態(tài) 植物幼苗或新生枝的完全伸展葉片的葉肉組織是分離原生質(zhì)體的最方便、最合適的植物材料。葉肉細(xì)胞排列松散，酶試劑很容易達(dá)到細(xì)胞壁。用于分離原生質(zhì)體的愈傷組織或懸浮細(xì)胞應(yīng)當(dāng)處于生長(zhǎng)早期或指數(shù)生長(zhǎng)期。 采用愈傷組織或懸浮細(xì)胞，采用其材料可以避免植株生長(zhǎng)環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細(xì)胞的年齡，處理

4、時(shí)操作方便，無需消毒。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,2 酶纖維素和半纖維素是細(xì)胞壁的初生結(jié)構(gòu)和次生結(jié)構(gòu)的成分，果膠類物質(zhì)是連接細(xì)胞胞間層的成分。纖維素酶（降解構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素）、半纖維素酶、果膠酶（使細(xì)胞從組織中分開，以及細(xì)胞與細(xì)胞分開）酶活性與pH有關(guān)，4.7~6.0，溫度一般在25~30℃,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,3 滲透劑 原生質(zhì)體直接釋放到培養(yǎng)基中會(huì)破裂，因此，在分離原生質(zhì)體期間，須對(duì)原來細(xì)胞壁機(jī)械維持壓

5、力用原生質(zhì)體分離混合液以及后來培養(yǎng)基的適當(dāng)滲透壓代替。在合適的滲透壓溶液中，剛分離的原生質(zhì)體看起來是球狀的。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,4 原生質(zhì)體的純化 酶消化后得到的混合物含有亞細(xì)胞碎片、未消化的細(xì)胞、破碎的和完整的原生質(zhì)體?？赏ㄟ^對(duì)此混合物通過過濾、離心、漂洗聯(lián)合的方法進(jìn)行純化。1） 收集：原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng)（40~100μm）去掉沒有降解的細(xì)胞及組織，收集濾液。2）洗滌：將網(wǎng)下物低速離心，去掉上清液，再加無酶

6、液的CPW液懸起起原生質(zhì)體，再離心，棄上清，重復(fù)幾次即可。,,3）純化（上浮法和下沉法）上浮法是將酶解的原生質(zhì)體與蔗糖溶液（23%左右）混合。下沉法是講原生質(zhì)體與13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個(gè)界面。兩種方法中，均在離心5~10分鐘后，在蔗糖溶液頂部形成一條原生質(zhì)體帶。用吸管將帶輕輕吸出來，懸浮離心，稀釋后用于培養(yǎng)。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,5 原生質(zhì)體的活力測(cè)定和密度 原生質(zhì)體的真正活力使

7、原生質(zhì)體有能力通過持續(xù)有絲分裂，再生成愈傷組織，并最終再生成植株。 測(cè)定原生質(zhì)體活力的方法主要有：FDA（熒光素二乙酸）染色法；酚藏紅花（CFW）染色法；測(cè)定呼吸強(qiáng)度法等。,影響原生質(zhì)體分離的因素,6 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)去除銨，因?yàn)樗鼘?duì)原生質(zhì)體的生存是有害的，而鐵、鋅的含量也應(yīng)當(dāng)減少。另外，鈣的濃度應(yīng)當(dāng)比通常培養(yǎng)細(xì)胞所需的 濃度增加2~4倍，提高鈣的濃度能改善膜的穩(wěn)定性。 葡萄糖是最好最可靠的

8、碳源，其次為蔗糖。7 環(huán)境因子 一般來說，剛開始培養(yǎng)時(shí)高光強(qiáng)會(huì)抑制原生質(zhì)體的生長(zhǎng)，因此應(yīng)先在黑暗或弱光下培養(yǎng)幾天，再將其轉(zhuǎn)移到一般光強(qiáng)下培養(yǎng)。溫度范圍20~28度適宜，pH范圍5.5~5.9適宜。,三、原生質(zhì)體培養(yǎng),原生質(zhì)體培養(yǎng)1. 液體淺層培養(yǎng)（Liquid thin layer culture）原生質(zhì)體純化后，將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中，取少許于培養(yǎng)皿底部形成很薄的一層，封口培養(yǎng)。2. 固體培養(yǎng)（So

9、lid culture）也叫瓊脂糖平板法或包埋培養(yǎng)法。將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑（瓊脂或瓊脂糖）按一定比例混合，在培養(yǎng)皿底部形成一薄層，凝固后封口培養(yǎng)。3. 固液雙層培養(yǎng)法（Solid over liquid culture）即先在培養(yǎng)皿底部鋪一層固體培養(yǎng)基，待凝固后再在其上進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以被液體層中的原生質(zhì)體吸收利用，而原生質(zhì)體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收。,細(xì)胞再生,（1

10、）細(xì)胞壁形成不同植物原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁所需時(shí)間不一樣，從幾小時(shí)到幾天。原生質(zhì)體失去其圓球形特征表明了新細(xì)胞壁的再生。簡(jiǎn)單鑒別壁再生的方法是用熒光增白劑（CFW）染色法檢測(cè)到。（2）細(xì)胞分裂第一次細(xì)胞分裂一般發(fā)生在2~7d內(nèi)，分裂活躍的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體與葉片高度分化細(xì)胞的原生質(zhì)體相比，前者進(jìn)入第一次細(xì)胞分裂較快。（3）植株再生具有再生能力的原生質(zhì)體就會(huì)不斷分裂形成多細(xì)胞團(tuán)。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)一步發(fā)育成為肉眼可見的小愈傷組織，要

11、及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（Differentiation medium）中，培養(yǎng)與再生過程同一般的愈傷組織培養(yǎng)。,體細(xì)胞雜交,離體條件下，通過分離體細(xì)胞原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜合體，再通過其異核體的發(fā)育形成雜種植株的技術(shù)被稱為體細(xì)胞雜交。這個(gè)程序消除了雜交中性別因素?？朔挥H和性障礙，成為植物基因的遺傳操作方法。在體細(xì)胞雜交中，親本的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)在雜種細(xì)胞中融合了。有時(shí)，融合的雜合體中只有一個(gè)親本的核基因，而有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基

12、因，這樣的雜種叫胞質(zhì)雜種。,體細(xì)胞雜交,物種間生殖隔離阻礙了物種之間的基因交流，從而給作物育種帶來很大的局限性。原生質(zhì)體融合技術(shù)是實(shí)現(xiàn)基因重組的一條新途徑，目前利用細(xì)胞融合已從很多物種、屬間，甚至科間獲得體細(xì)胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型。,,原生質(zhì)體融合技術(shù)體系大致包括三大環(huán)節(jié)：誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合選擇融合體或雜種細(xì)胞雜種植株的再生與鑒定,(一) 原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion）是指不同種

13、類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程。1 自然融合（Spontaneous fusion） 來源于分裂旺盛細(xì)胞的原生質(zhì)體，自發(fā)融合的頻率較高。小孢子來源的原生質(zhì)體融合率可高達(dá)50~70%。實(shí)際上自然條件下受精就是一種自發(fā)融合。,(一) 原生質(zhì)體融合,2 誘發(fā)融合1) NaNO3處理法 Power 于1970年采用NaNO3溶液誘導(dǎo)燕麥與玉米根尖原生質(zhì)體融合，首次得到融合體。1972年，美國學(xué)

14、者Carlson等采用此法獲得郎氏煙草與粉藍(lán) 煙草體細(xì)胞雜種，這是植物中首例體細(xì)胞雜種。 缺點(diǎn)是Na+造成膜電位的改變。融合頻率低。2) 高pH-高鈣法 Keller和Melchers于1973年報(bào)道采用高濃度Ca2+的強(qiáng)堿溶液處理煙草葉肉原生質(zhì)體，可以使融合頻率大幅度增加，達(dá)到50%。之后，采用此方法成功獲得了煙草種間和屬間體細(xì)胞雜種。,,3)水溶性多聚體——聚乙二醇（PEG）法 最成功的原生質(zhì)體融合技術(shù)。

15、1976年Kao發(fā)現(xiàn)用含高濃度Ca2+的強(qiáng)堿溶液清洗PEG誘導(dǎo)和原生質(zhì)體時(shí)，融合頻率得到到進(jìn)一步提高，因而發(fā)展起高pH-PEG法。PEG誘導(dǎo)小麥與玉米融合產(chǎn)生不育雜種,,,4)電融合法（Electrofusion）主要是雙向電泳法，其基本原理：與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點(diǎn)：一是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。,,電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后

16、，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。,體細(xì)胞雜種的特點(diǎn),形態(tài)上的趨中性 變異幅度大 非整倍性 雙親性狀的共顯性 偏親現(xiàn)象,雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定,1．雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng) 外觀選擇?

17、 互補(bǔ)選擇? 熒光標(biāo)記選擇,,2．體細(xì)胞雜種的鑒定任何兩個(gè)種的原生質(zhì)體都可以融合在一起。然而，高等植物體細(xì)胞雜交的廣泛利用收到一些限制，包括非整倍體、雜交的種障礙和不可能從原生質(zhì)體再生成植株等。雜種性的鑒定要求有證明兩個(gè)融合親本遺傳貢獻(xiàn)的清楚證據(jù)，而雜種性只能來源于整倍體，而不能來源于非整倍體。,,形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進(jìn)行鑒定。雜種在形態(tài)上往往介于雙親之間，包括株型、葉形、花器官等,,細(xì)胞學(xué)鑒定：細(xì)胞器鑒定、染色

18、體鑒定。染色體計(jì)數(shù)：染色體數(shù)目是雙親之和，或少1至幾條染色體。所以，細(xì)胞融合可以創(chuàng)造非整倍體。代換系、染色體片段置換系等珍貴的遺傳學(xué)研究材料。這些遺傳材料對(duì)于基因定位、確定染色體與分子標(biāo)記連鎖群的關(guān)系、育種等有重要應(yīng)用價(jià)值。,,生化鑒定：同功酶鑒定分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定是最有效的檢測(cè)手段，尤其是細(xì)胞學(xué)無法確定是雜種的時(shí)候，分子標(biāo)記更有用，它能檢測(cè)出遺傳物質(zhì)的細(xì)小重組。,體細(xì)胞雜種的遺傳特性,1．細(xì)胞分裂與染色體丟

19、失 如果細(xì)胞分裂而核不發(fā)生融合，在以后的發(fā)育過程中就會(huì)有兩種結(jié)果，一是細(xì)胞分裂幾次以后即停止生長(zhǎng)從而導(dǎo)致死亡；二是在發(fā)育過程中某一親本的細(xì)胞核部分或全部丟失。如果這樣就會(huì)產(chǎn)生幾種情況：A細(xì)胞＋B細(xì)胞質(zhì)；A細(xì)胞＋B細(xì)胞質(zhì)和部分染色體或基因。,體細(xì)胞雜種的遺傳特性,2．基因轉(zhuǎn)移與性狀表達(dá) 由于染色體的部分丟失，常常使某個(gè)親本的部分或個(gè)別基因與另一親本的染色體發(fā)生整合，其結(jié)果是實(shí)現(xiàn)了親本間的基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移通常是在后代中某些

20、性狀得以表達(dá)，有時(shí)由于基因的重組也可能產(chǎn)生雙親均沒有的新性狀。 3．體細(xì)胞雜種遺傳上的不穩(wěn)定性 體細(xì)胞雜種后代在遺傳上常常不穩(wěn)定，這可能涉及到多方面的因素，如親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近、培養(yǎng)過程中的染色體變異、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的重組等。,體細(xì)胞雜種的應(yīng)用,一、體細(xì)胞雜種的應(yīng)用潛力1、 植物育種中的核質(zhì)替換2、 細(xì)胞質(zhì)雜種的獲得3、 遠(yuǎn)緣雜交創(chuàng)造新物種4、 細(xì)胞器的互作研究,體細(xì)胞雜種的應(yīng)用,二、體細(xì)胞雜交面臨的困難1