Notch1對子宮內膜異位癥內膜干細胞增殖分化的調控.pdf

1、目的:
　　1.從人子宮在位內膜中分離培養(yǎng)子宮內膜間質細胞和腺上皮細胞,運用平板克隆形成法純化子宮內膜間質干細胞和腺上皮干細胞,并通過干細胞標志物的表達來鑒定干細胞。
　　2.構建 Notch1慢病毒表達載體(Notch1-shRNA),并提取病毒上清。
　　3.體外研究 Notch1-shRNA干預子宮內膜間質干細胞和腺上皮干細胞后,兩種子宮內膜干細胞的干細胞活性和分化標志物的變化及其遷移和侵襲能力的變化。
　

2、　方法:
　　1.在位子宮內膜腺上皮細胞和間質細胞的原代培養(yǎng),并運用平板克隆形成實驗純化子宮內膜干細胞。采用real time PCR和western blot法分別檢測上皮細胞標志物EMA、CK、CD49f和間質細胞標志物THY-1(CD90)、collagen type I、5B5、vimentin在子宮內膜腺上皮干細胞和間質干細胞的表達。
　　2.構建Lentivirus(LV)-靶向Notch1基因-shRNA載體并

3、獲取病毒上清,測定病毒滴度。
　　3.觀察LV-Notch1-shRNA對人子宮內膜干細胞的干細胞活性和分化標志物的影響及對人子宮內膜干細胞遷移和侵襲能力的影響:運用課題組前期建立的技術原代培養(yǎng)人異位內膜細胞,immunohistochemistry(IHC)鑒定,運用平板克隆形成法純化子宮內膜干細胞。將重組慢病毒在體外感染純化獲得的內膜干細胞,分別以空載慢病毒感染的內膜干細胞作為陰性對照。采用real time PCR法分別檢測

4、各組內膜干細胞中BMI1、CD133、Oct4、Sox2和Nanog mRNA表達的變化,用平板克隆形成實驗檢測干細胞的克隆形成能力,transwell小室測定內膜干細胞侵襲能力。
　　結果:
　　1.原代培養(yǎng)子宮內膜細胞經免疫細胞化學法鑒定后,光學顯微鏡觀察:腺上皮細胞呈團狀排列生長,細胞呈多角形或蝌蚪形,邊界清楚,排列緊密,胞漿飽滿,核圓大;間質細胞呈多角形或梭形排列,胞漿薄而透明,核橢圓。運用平板克隆形成法純化內膜干細

5、胞,當50個/cm2時,子宮內膜細胞克隆形成能力最強。
　　2.經陽性克隆 PCR鑒定及測序分析,結果顯示合成的Notch1-ShRNA序列插入正確。經純化濃縮后產生的慢病毒滴度為8×10TU/ml。
　　3.免疫熒光細胞化學染色可見呈紅色發(fā)光顆粒,說明Notch1蛋白主要定位于子宮內膜間質干細胞和腺上皮干細胞的細胞漿和細胞核中,干擾Notch1后細胞Notch1蛋白明顯減少,而空載對照未干擾Notch1的細胞株蛋白表達明顯

6、。
　　4.在子宮內膜腺上皮干細胞中與對照組比較,Notch1蛋白表達水平具有顯著性差異(P<0.05)。在子宮內膜間質上皮干細胞中與對照組比較,Notch1蛋白表達具有顯著性差異(P<0.05)。子宮內膜腺上皮干細胞和間質干細胞中Notch1的表達均被明顯抑制,較對照組其抑制效率超過70％(P<0.05),而作為對照采用con-shRNA干擾的細胞中Notch1的表達無明顯改變。
　　5.子宮內膜腺上皮干細胞和間質干細胞中

7、采用慢病毒 Notch1-shRNA干擾后影響干細胞表型的標志物 BMI1、c-Myc、Sox2、Oct4、Nanog、CD133的表達均有不同程度的下降(P<0.05)。子宮內膜腺上皮干細胞和間質干細胞中采用慢病毒Notch1-shRNA干擾后影響細胞克隆形成率均有不同程度的下降(P<0.05)。
　　6.慢病毒干擾沉默 Nocth1基因后子宮內膜間質干細胞遷移率明顯下降,24小時劃痕愈合率為48％vs75％,差異具有明顯意義(

8、P<0.05);子宮內膜腺上皮干細胞遷移率明顯下降,24小時劃痕愈合率為48％vs78％,差異具有明顯意義(P<0.01)。
　　7.采用Transwell侵襲小室測定法得出子宮內膜間質干細胞和腺上皮干細胞的侵襲能力,結果顯示兩種細胞的侵襲能力明顯下降,24小時培養(yǎng)后穿過 Transwell的每低倍視野細胞數分別為33.37±3.3、46±5.4,差異具有顯著性意義(P<0.05)。
　　結論:
　　1.從在位子宮內膜

9、中分離純化出的子宮內膜干細胞的上皮干細胞表面標志物 EMA、CK、CD49f及間質干細胞標志物 THY-1、collagen type I、5B5、vimentin在子宮內膜間質和腺上皮干細胞中表達明顯高于非子宮內膜間質和腺上皮干細胞,且所鑒定蛋白的表達與 mRNA表達的結果一致。說明人子宮中存在內膜干細胞,并且與內異癥的發(fā)病相關。
　　2.成功構建了LV-Notch1-shRNA,并獲得了高滴度的重組慢病毒上清液。
　　3