Notch1對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控.pdf

1、目的:
　　1.從人子宮在位內(nèi)膜中分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞,運(yùn)用平板克隆形成法純化子宮內(nèi)膜間質(zhì)干細(xì)胞和腺上皮干細(xì)胞,并通過(guò)干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)來(lái)鑒定干細(xì)胞。
　　2.構(gòu)建 Notch1慢病毒表達(dá)載體(Notch1-shRNA),并提取病毒上清。
　　3.體外研究 Notch1-shRNA干預(yù)子宮內(nèi)膜間質(zhì)干細(xì)胞和腺上皮干細(xì)胞后,兩種子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的干細(xì)胞活性和分化標(biāo)志物的變化及其遷移和侵襲能力的變化。
　

2、　方法:
　　1.在位子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng),并運(yùn)用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)純化子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。采用real time PCR和western blot法分別檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志物EMA、CK、CD49f和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物THY-1(CD90)、collagen type I、5B5、vimentin在子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)。
　　2.構(gòu)建Lentivirus(LV)-靶向Notch1基因-shRNA載體并

3、獲取病毒上清,測(cè)定病毒滴度。
　　3.觀察LV-Notch1-shRNA對(duì)人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的干細(xì)胞活性和分化標(biāo)志物的影響及對(duì)人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響:運(yùn)用課題組前期建立的技術(shù)原代培養(yǎng)人異位內(nèi)膜細(xì)胞,immunohistochemistry(IHC)鑒定,運(yùn)用平板克隆形成法純化子宮內(nèi)膜干細(xì)胞。將重組慢病毒在體外感染純化獲得的內(nèi)膜干細(xì)胞,分別以空載慢病毒感染的內(nèi)膜干細(xì)胞作為陰性對(duì)照。采用real time PCR法分別檢測(cè)

4、各組內(nèi)膜干細(xì)胞中BMI1、CD133、Oct4、Sox2和Nanog mRNA表達(dá)的變化,用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干細(xì)胞的克隆形成能力,transwell小室測(cè)定內(nèi)膜干細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定后,光學(xué)顯微鏡觀察:腺上皮細(xì)胞呈團(tuán)狀排列生長(zhǎng),細(xì)胞呈多角形或蝌蚪形,邊界清楚,排列緊密,胞漿飽滿,核圓大;間質(zhì)細(xì)胞呈多角形或梭形排列,胞漿薄而透明,核橢圓。運(yùn)用平板克隆形成法純化內(nèi)膜干細(xì)

5、胞,當(dāng)50個(gè)/cm2時(shí),子宮內(nèi)膜細(xì)胞克隆形成能力最強(qiáng)。
　　2.經(jīng)陽(yáng)性克隆 PCR鑒定及測(cè)序分析,結(jié)果顯示合成的Notch1-ShRNA序列插入正確。經(jīng)純化濃縮后產(chǎn)生的慢病毒滴度為8×10TU/ml。
　　3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色可見呈紅色發(fā)光顆粒,說(shuō)明Notch1蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜間質(zhì)干細(xì)胞和腺上皮干細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中,干擾Notch1后細(xì)胞Notch1蛋白明顯減少,而空載對(duì)照未干擾Notch1的細(xì)胞株蛋白表達(dá)明顯

6、。
　　4.在子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞中與對(duì)照組比較,Notch1蛋白表達(dá)水平具有顯著性差異(P<0.05)。在子宮內(nèi)膜間質(zhì)上皮干細(xì)胞中與對(duì)照組比較,Notch1蛋白表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05)。子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞中Notch1的表達(dá)均被明顯抑制,較對(duì)照組其抑制效率超過(guò)70％(P<0.05),而作為對(duì)照采用con-shRNA干擾的細(xì)胞中Notch1的表達(dá)無(wú)明顯改變。
　　5.子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞中

7、采用慢病毒 Notch1-shRNA干擾后影響干細(xì)胞表型的標(biāo)志物 BMI1、c-Myc、Sox2、Oct4、Nanog、CD133的表達(dá)均有不同程度的下降(P<0.05)。子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞中采用慢病毒Notch1-shRNA干擾后影響細(xì)胞克隆形成率均有不同程度的下降(P<0.05)。
　　6.慢病毒干擾沉默 Nocth1基因后子宮內(nèi)膜間質(zhì)干細(xì)胞遷移率明顯下降,24小時(shí)劃痕愈合率為48％vs75％,差異具有明顯意義(

8、P<0.05);子宮內(nèi)膜腺上皮干細(xì)胞遷移率明顯下降,24小時(shí)劃痕愈合率為48％vs78％,差異具有明顯意義(P<0.01)。
　　7.采用Transwell侵襲小室測(cè)定法得出子宮內(nèi)膜間質(zhì)干細(xì)胞和腺上皮干細(xì)胞的侵襲能力,結(jié)果顯示兩種細(xì)胞的侵襲能力明顯下降,24小時(shí)培養(yǎng)后穿過(guò) Transwell的每低倍視野細(xì)胞數(shù)分別為33.37±3.3、46±5.4,差異具有顯著性意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.從在位子宮內(nèi)膜

9、中分離純化出的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的上皮干細(xì)胞表面標(biāo)志物 EMA、CK、CD49f及間質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物 THY-1、collagen type I、5B5、vimentin在子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮干細(xì)胞中表達(dá)明顯高于非子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮干細(xì)胞,且所鑒定蛋白的表達(dá)與 mRNA表達(dá)的結(jié)果一致。說(shuō)明人子宮中存在內(nèi)膜干細(xì)胞,并且與內(nèi)異癥的發(fā)病相關(guān)。
　　2.成功構(gòu)建了LV-Notch1-shRNA,并獲得了高滴度的重組慢病毒上清液。
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