血紅蛋白的提取和分離教案

1、血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離一.蛋白質(zhì)分離的依據(jù)蛋白質(zhì)分離的依據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力和對(duì)其他分子的親和力等可以用來提取和分離不同種類的蛋白質(zhì)。二、凝膠色譜法二、凝膠色譜法1.概念:也稱做分配色譜法分配色譜法是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。2.凝膠色譜法原理凝膠色

2、譜法原理(1)由多糖類化合物多糖類化合物構(gòu)成的凝膠內(nèi)部有許多貫穿的通道通道。(2)當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí)相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道路程較長(zhǎng)較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢較慢而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道只能在凝膠外部凝膠外部移動(dòng)路程較短較短移動(dòng)速度較快較快從而使相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離。(1)識(shí)圖析圖圖a相對(duì)分子質(zhì)量

3、較小的蛋白質(zhì)由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)被排阻在凝膠顆粒外面在顆粒之間迅速通過。圖b①蛋白質(zhì)混合物上柱②洗脫開始相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)則被排阻于顆粒之外③相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)被滯留相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)向下移動(dòng)④相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子完全分開⑤相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)行程較短已從層析柱中洗脫出來相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)還在行進(jìn)中。相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分

4、子因此得以分離。洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動(dòng)。三、緩沖溶液三、緩沖溶液1.作用:在一定范圍內(nèi)緩沖溶液能抵制外界的酸和堿酸和堿對(duì)溶液pH的影響維持pH基本不變基本不變。2.配制:由1～2種緩沖劑溶解于水中水中配制而成通過調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例使用比例就可以得到在不同pH范圍內(nèi)使用的緩沖液。注意：注意：在血紅蛋白整個(gè)實(shí)驗(yàn)室中用的緩沖液是磷酸緩沖液磷酸緩沖

5、液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PHPH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）。四、電泳四、電泳1.概念:指帶電粒子帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移遷移的過程。(3)(3)分離血紅蛋白溶液：分離血紅蛋白溶液：①過程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000rmin的速度離心10min。②目的：經(jīng)過離心使血紅蛋白和其它雜質(zhì)分離開來使血紅蛋白和其它雜質(zhì)

6、分離開來，便于下一步對(duì)血紅蛋白的純化③試管中溶液層次：攪拌好的混合液離心后明顯分為4層（如下圖），由上至下依次是甲苯層、脂溶性物甲苯層、脂溶性物質(zhì)的沉淀層、血紅蛋白的水溶液、紅細(xì)胞破碎物沉淀質(zhì)的沉淀層、血紅蛋白的水溶液、紅細(xì)胞破碎物沉淀。第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）④分離：用濾紙過濾，除去脂

7、溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。2、血紅蛋白的粗分離、血紅蛋白的粗分離透析：透析：①原理：原理：透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)使小分子自由進(jìn)出，而大分子保留在袋內(nèi)。②過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmoll（按1:300的比例）的磷酸緩沖液磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時(shí)。③目的目的：a一是一是除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)除去樣品

8、中分子量較小的雜質(zhì)。b、二是使血紅蛋白處于緩沖液環(huán)境中，便于后續(xù)的磷酸緩沖液在凝膠柱中進(jìn)行洗脫。3、分離純化血紅蛋白、分離純化血紅蛋白凝膠色譜操作凝膠色譜操作:(1)(1)凝膠色譜柱的制作凝膠色譜柱的制作①取長(zhǎng)40cm內(nèi)徑為1.6cm的玻璃管兩端磨平。②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)再用100目的尼龍紗包好。③頂塞制作:插入安裝了玻璃管的橡皮塞。④組裝:將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安接其他附屬結(jié)構(gòu)。特別

9、提醒：凝膠色譜柱的直徑大小不影響分離效果特別提醒：凝膠色譜柱的直徑大小不影響分離效果但直徑過大造成洗脫但直徑過大造成洗脫液體積大液體積大樣品稀釋度大樣品稀釋度大凝膠色譜柱的高度與分離度有關(guān)。凝膠色譜柱的高度與分離度有關(guān)。(2)(2)凝膠色譜柱的裝填凝膠色譜柱的裝填①、凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值凝膠的得水值，即