巨噬細(xì)胞集落刺激因子與微小染色體維持蛋白7的相互作用及其對(duì)DNA復(fù)制的影響.pdf

1、目的：建立核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）的細(xì)胞系，驗(yàn)證核內(nèi)M-CSF與微小染色體維持蛋白7（Mcm7）的分子間相互作用，初步探討M-CSF-Mcm7相互作用對(duì)細(xì)胞DNA復(fù)制的影響。 方法：將M-CSF核定位重組表達(dá)載體pCMV/nuc/M-CSF、空載體pCMV/nuc/myc及陽性對(duì)照載體pCMV/nuc/GFP分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，經(jīng)G418篩選并擴(kuò)增陽性克隆后，用RT-PCR、Western blot和免疫

2、熒光染色證實(shí)陽性克隆有否表達(dá)M-CSF及其定位；免疫共沉淀法驗(yàn)證核內(nèi)M-CSF與其靶分子Mcm7的相互作用，BrdU標(biāo)記法分析M-CSF與Mcm7分子間相互作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的影響，構(gòu)建無細(xì)胞體外復(fù)制分析體系研究M-CSF與Mcm7結(jié)合作用于DNA復(fù)制的起始還是延伸階段。 結(jié)果：RT-PCR、Western blot 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pCMV/nuc/M-CSF的HeLa細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)M-CSF mRNA和蛋白，免疫熒光染色示M

3、-CSF的表達(dá)定位于細(xì)胞核；抗Mcm7單克隆抗體能沉淀轉(zhuǎn)染pCMV/nuc/M-CSF的HeLa細(xì)胞中的M-CSF，提示：M-CSF與Mcm7直接結(jié)合；BrdU標(biāo)記法顯示：M-CSF與Mcm7的相互作用可促進(jìn)DNA的復(fù)制；表達(dá)M-CSF的細(xì)胞核不論處于G1期還是S期，其復(fù)制能力均比對(duì)照組強(qiáng)，提示DNA復(fù)制的起始和延伸都受M-CSF與Mcm7相互作用的調(diào)節(jié)。 結(jié)論：成功建立了一個(gè)核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的HeLa細(xì)胞系； M-CSF