巨噬細(xì)胞集落刺激因子及其受體在糖尿病視網(wǎng)膜的表達(dá)及對(duì)體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的:通過巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)及其受體(CSF-1R)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜表達(dá)及對(duì)體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的作用研究,探討糖尿病視網(wǎng)膜病變中微環(huán)境的變化對(duì)視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活機(jī)制及作用。
　　 方法:體內(nèi)部分 采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌霉素(streptozotocin,STZ)方法建立成年SD(Sprague-Dawley)

2、大鼠糖尿病動(dòng)物模型。在建模后2,4,8,12周,隨機(jī)取8只糖尿病大鼠視網(wǎng)膜,冰凍切片行免疫組織化學(xué),激光共聚焦顯微鏡下觀察M-CSF及其受體CSF-1R在視網(wǎng)膜的表達(dá)情況,免疫熒光雙標(biāo)染色觀察視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞(CD11b/C)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、Müller細(xì)胞(Vimentin)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(NeuN)中的共表達(dá)情況。Real-time PCR、Western blot法測(cè)量各組大鼠視網(wǎng)膜M-CSF和CSF-1R的mRNA及蛋

3、白質(zhì)表達(dá)量的變化。均采用同齡大鼠5只作為對(duì)照。此外,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定22例增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(PDR)患者玻璃體樣本中M-CSF的蛋白含量,22例特發(fā)性黃斑裂孔的玻璃體樣本作為對(duì)照。
　　 體外部分 原代視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)鑒定。采用糖基化人體白蛋白(GA)刺激小膠質(zhì)細(xì)胞,光鏡、免疫熒光染色觀察作用前后小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及激活標(biāo)志Ibal、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1 β的表達(dá)變化。

4、ELISA法測(cè)量激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β和M-CSF的蛋白含量變化情況。免疫熒光染色法、Real-time PCR、Western blot及免疫沉淀法測(cè)量GA激活的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞CSF-1R的表達(dá)變化。ELISA法分別測(cè)量M-CSF組、M-CSF抗體組、CSF-1 R抗體組、GA+M-CSF組、GA+M-CSF抗體組、GA+CSF-1 R抗體組TNF-α和IL-1β蛋白含量的變化,單獨(dú)GA組的小膠質(zhì)細(xì)胞作為對(duì)照。<

5、br>　　 結(jié)果:體內(nèi)部分 正常大鼠視網(wǎng)膜上可持續(xù)低水平表達(dá)M-CSF及受體CSF-1R。在糖尿病大鼠2周,視網(wǎng)膜上M-CSF及其受體CSF-1R mRNA、蛋白的表達(dá)水平均較同齡對(duì)照組明顯上調(diào)(p＜0.005),并隨時(shí)間推移繼續(xù)增加。免疫熒光雙標(biāo)染色顯示M-CSF的免疫活性上調(diào)主要發(fā)生在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的神經(jīng)纖維層,與GFAP共表達(dá)。上調(diào)的CSF-1R免疫活性主要在0X-42標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞。NeuN標(biāo)記的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CSF-

6、1R。ELISA結(jié)果顯示PDR病人玻璃體中M-CSF的蛋白含量明顯高于對(duì)照組(p＜0.005)
　　 體外部分體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜小膠質(zhì)經(jīng)GA刺激后從桿狀靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘w更大、類圓型的阿米巴樣激活狀態(tài)。激活后的小膠質(zhì)Ibal表達(dá)明顯增強(qiáng),并從胞槳轉(zhuǎn)移到胞膜皺褶上。GA刺激后小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β(P＜0.05),呈劑量依賴方式,GA濃度為250μg/ml時(shí)達(dá)到釋放峰值。免疫熒光、Real-time PCR及免疫沉淀顯

7、示GA激活的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CSF-1R明顯上調(diào)(P＜0.05),而未經(jīng)GA刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞僅表達(dá)基線水平的CSF-1R?？贵w中和試驗(yàn)顯示M-CSF抗體或CSF-1R抗體中和可明顯降低GA激活的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放TNF-α僅和IL-1 β(P＜0.001)。M-CSF本身不能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α和IL-1β的釋放,但M-CSF+GA組TNF-α和IL-1 β的含量明顯高于單純GA刺激組(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.糖尿病早期