熱處理對(duì)沙梨離體植株體內(nèi)microRNAs和來(lái)源于ASGV的vsiRNAs的影響.pdf

1、我國(guó)梨產(chǎn)區(qū)種植的梨樹(shù)普遍感染蘋(píng)果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)，對(duì)樹(shù)勢(shì)、產(chǎn)量和品質(zhì)都有嚴(yán)重影響。目前，預(yù)防果樹(shù)病毒的有效措施是獲得無(wú)病毒苗木，而熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)是獲取無(wú)病毒苗的有效方法，但熱處理脫除病毒的分子機(jī)理尚不清楚。本研究對(duì)37℃ld、5d莖尖組織混合樣品，24℃1d、5d莖尖組織混合樣品分別進(jìn)行small RNA高通量測(cè)序和qRT-PCR分析驗(yàn)證，一方面探索熱處理對(duì)梨miRNA以及

2、miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因的影響，另一方面探索熱處理對(duì)沙梨中ASGV基因沉默發(fā)生的影響，旨在明確熱處理脫除梨莖尖病毒分子機(jī)理。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴ASGV-J2全長(zhǎng)序列擴(kuò)增及分析:ASGV-J2基因組全長(zhǎng)為6497nt（不含PloyA尾），與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的17個(gè)ASGV分離物的基因組核苷酸相似性為79.6-82.6％，其中與來(lái)源于日本的蘋(píng)果分離物P-209和中國(guó)蘋(píng)果分離物T-47相似性最高，均為82.6％。ASGV-J2基因組

3、結(jié)構(gòu)同其它ASGV分離物相同，包括兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF1和ORF2）。ORF1編碼的外殼蛋白cp基因與報(bào)道的中國(guó)分離物氨基酸相似性為94.1-98.7％，與來(lái)源中國(guó)的蘋(píng)果分離物YTG相似性最高。ASGV-J2基因組核苷酸序列和cp氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)分析表明，不同ASGV分離物具有明顯的寄主選擇性。本研究明確了侵染“金水二號(hào)”ASGV-J2分離物分子特性，進(jìn)一步為熱處理對(duì)“金水二號(hào)”寄主體內(nèi)來(lái)源于ASGV的vsiRNAs的研究提供材料。<

4、br>　　⑵小RNA高通量測(cè)序發(fā)掘不同溫度處理?xiàng)l件下被ASGV感染的沙梨“金水二號(hào)”莖尖組織部位microRNAs的分析:24℃和37℃條件下共鑒定了149個(gè)已知miRNA，在梨寄主中表達(dá)量相對(duì)較高;熱處理?xiàng)l件下7個(gè)miRNA顯著差異表達(dá)，其中4個(gè)差異表達(dá)miRNA共預(yù)測(cè)到51個(gè)靶標(biāo)基因;保守家族miRNA156和miRNA159分別有4個(gè)成員，其余多為2個(gè)成員。另外，共鑒定了144個(gè)新的miRNA，在梨莖尖文庫(kù)中表達(dá)量均較低;其中77

5、個(gè)miRNA為熱處理?xiàng)l件下顯著差異表達(dá)，其中64個(gè)差異表達(dá)miRNA預(yù)測(cè)到693個(gè)靶標(biāo)基因。新的miRNA成熟序列5'端第一個(gè)堿基為U，表明miRNA行使功能時(shí)對(duì)AGO1蛋白有偏好性;熱處理?xiàng)l件下梨差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶標(biāo)基因GO功能分析表明，靶基因涉及代謝，刺激反應(yīng)等生物過(guò)程，參與抗病防衛(wèi)反應(yīng)，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等;表明熱處理誘導(dǎo)下miRNA在梨寄主基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面有重要作用，在寄主與病原互作中起重要調(diào)控作用。
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6、件miRNA及靶基因表達(dá)模式與病毒累積量的對(duì)應(yīng)分析:采用qRT-PCR法對(duì)37℃熱處理?xiàng)l件下差異表達(dá)顯著的miRNA(選取4個(gè)已知miRNA，8個(gè)新的miRNA)在梨莖尖和基部組織部位表達(dá)模式進(jìn)行分析，驗(yàn)證結(jié)果表明9個(gè)miRNA在梨莖尖組織表達(dá)量與小RNA高通量測(cè)序分析結(jié)果一致;結(jié)合miRNA在梨基部與莖尖部位不同表達(dá)模式，從而表明熱處理?xiàng)l件下梨寄主miRNA表達(dá)模式具有組織特異性。另外，關(guān)聯(lián)分析了miRNA靶標(biāo)基因在梨莖尖和基部的表達(dá)

7、模式，結(jié)果表明莖部組織miRNA大多負(fù)調(diào)控相應(yīng)靶標(biāo)基因。ASGV外殼蛋白cp基因在熱處理?xiàng)l件下梨莖尖和基部表達(dá)量均降低，表明熱處理抑制了病毒在寄主體內(nèi)的復(fù)制。因此，熱處理?xiàng)l件下miRNA及調(diào)控靶標(biāo)基因在梨莖尖和基部表達(dá)模式與病毒積累量的對(duì)應(yīng)分析結(jié)果揭示了miRNA調(diào)控靶標(biāo)基因在降低梨病毒濃度過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。
　?、葻崽幚韺?duì)來(lái)源于ASGV的vsiRNAs的影響:24℃和37℃條件下，來(lái)源于ASGV的vsiRNA數(shù)量分別為7

8、495 reads和7949 reads，長(zhǎng)度大小均以21nt和22nt為主;vsiRNAs對(duì)正鏈具有一定偏向性。vsiRNAs在ASGV基因組上分布無(wú)明顯差異，表明高溫并沒(méi)有觸發(fā)vsiRNAs表達(dá)量增多。采用qRT-PCR分析37℃與24℃處理?xiàng)l件下，來(lái)源于ASGV正義鏈ORF1、RdRp、Helicase區(qū)域及負(fù)義鏈ORF1、CP區(qū)域的vsiRNA的表達(dá)模式，結(jié)果表明熱處理對(duì)其表達(dá)量無(wú)明顯影響，與數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致;僅來(lái)源于ASGV負(fù)