來(lái)源于宏基因組的糖苷酶的篩選、性質(zhì)表征及應(yīng)用.pdf

1、環(huán)境微生物是自然界中分布最廣、種類最多、數(shù)量最大的生物類群，是蛋白和活性小分子資源的寶庫(kù)。但傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法對(duì)于這些微生物資源的開發(fā)利用是有其局限性的，因?yàn)榻^大部分環(huán)境微生物目前在實(shí)驗(yàn)室還是無(wú)法獲得培養(yǎng)的，這在很大程度上限制了人們對(duì)微生物資源的開發(fā)和利用。上個(gè)世紀(jì)90年代出現(xiàn)了宏基因組技術(shù)，使得開發(fā)不可培養(yǎng)微生物資源成為了現(xiàn)實(shí)，人們采用宏基因組技術(shù)，獲得了大量新的蛋白和生物活性小分子。
　　 為了進(jìn)一步探索糖苷酶的生物學(xué)意義，

2、使其在工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。本研究利用選擇性培養(yǎng)基從構(gòu)建深海淤泥的宏基因組文庫(kù)中，活性篩選到一株糖苷酶的克隆(GluD142)基因，克隆到的DNA序列全長(zhǎng)1395bp，編碼465氨基酸，分子量約為52.0kD。將其目的基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)宿主中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量可以達(dá)到總蛋白量的72.7％，并且目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。
　　 對(duì)糖苷酶

3、GluD142酶學(xué)性質(zhì)表征的結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃和pH值為7.5。該糖苷酶(GluD142)具有較好的熱穩(wěn)定性，在40℃的條件下可以較長(zhǎng)時(shí)間的保持活性，在45℃下保溫2h后仍能保持約50％的剩余相對(duì)活力。不同pH值條件下保溫16h后結(jié)果表明，該酶在pH值6.0-7.5條件下，仍能夠保持大于80％的剩余相對(duì)活力，在pH值5.5和pH值8.0時(shí)可以保持約50％的剩余相對(duì)活力，而在低于或高于此范圍時(shí)，GluD142的相對(duì)活力迅

4、速下降。Cu2+、Mn2+和Nj2+對(duì)該糖苷酶的水解活性有明顯的促進(jìn)作用，Mg2+和2n2+對(duì)于該糖苷酶的水解活性影響不大，而K+、Na+、Co2+以及Ca2+對(duì)于該糖苷酶的水解活性有很大的抑制作用。此酶在10％的甲醇、乙酸乙酯、丙酮以及正已烷中，其水解活性有120％-150％不等的提高。甚至在40％的正已烷中，GluD142的相對(duì)水解活性還可以保持近乎100％，DMSO有機(jī)溶劑對(duì)其水解活性有很明顯的抑制作用。
　　 用MCFs

5、載體固定此糖苷酶，催化合成烷基糖苷和白藜蘆醇，并對(duì)固定化條件進(jìn)行選擇，以及固定化糖苷酶對(duì)合成其產(chǎn)物反應(yīng)的條件進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在生成烷基糖苷的體系中，當(dāng)醇糖摩爾比為4:1，水相達(dá)到30％，在42℃，pH值6.5的條件下，反應(yīng)48h即可得到烷基糖苷初產(chǎn)品。通過(guò)對(duì)虎杖苷發(fā)酵工藝的研究，可以得到優(yōu)化的反應(yīng)體系，即當(dāng)酶液、虎杖苷溶液和緩沖液摩爾量在1:5:5的基礎(chǔ)上，37℃pH值6.5的條件下，反應(yīng)16h，即可得到白藜蘆醇初產(chǎn)物。