TRIM28在腫瘤中的表達分析及其與腫瘤相關性機制研究.pdf

1、目的:①構建pcDNA5-TRIM28重組質粒，建立可誘導穩(wěn)定表達pcDNA5-TRIM28-HEK293細胞系。②探討TRIM28基因在分子水平的調(diào)控作用及其在腫瘤中的表達。③TRIM28與腫瘤相關性及機制分析。
　　方法:首先，經(jīng)PCR技術、酶切消化、測序驗證和免疫印跡雜交技術，成功構建pcDNA5-TRIM28重組質粒和可誘導穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系。其次，提取TRIM28-HEK293細胞系蛋白質，同時設立

2、對照，通過雙向電泳，質譜鑒定，鑒定出TRIM28調(diào)節(jié)的靶基因，并設計靶基因引物。選取DOX最佳誘導時間(12h)和最佳誘導劑量(0.1μg/ml)誘導可穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系，提取RNA，在逆轉酶的作用下反轉錄成cDNA，以逆轉錄產(chǎn)物為模板，由11對基因的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增，驗證雙向電泳的結果。同時在HeLa細胞系中過表達TRIM28，轉染24h后提取RNA，在逆轉酶的作用下反轉錄成cDNA，以逆轉錄

3、產(chǎn)物為模板，由11對基因的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增，進一步驗證雙向電泳的結果。再次，提取7種不同腫瘤細胞系RNA，反轉錄成cDNA，以逆轉錄產(chǎn)物為模板，由TRIM28和內(nèi)參(18S RNA)的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增，通過熒光定量PCR檢測TRIM28在不同腫瘤細胞系中mRNA的表達水平。同時本實驗收集了11例癌旁正常乳腺組織標本和33例乳腺腫瘤組織標本，提取RNA，在逆轉酶的作用下反轉錄成cDNA，以cDNA為

4、模板，由TRIM28和內(nèi)參（18S RNA）的特異性擴增引物進行熒光定量PCR擴增，通過熒光定量PCR檢測TRIM28在癌旁正常組織和腫瘤組織中mRNA表達水平的差異。在4T1細胞系或者HeLa細胞系中過表達TRIM28，分別提取RNA及蛋白質，通過熒光定量PCR技術及Western blot技術檢測TRIM28、TWIST1與腫瘤的相關性及機制。
　　結果:成功構建pcDNA5-TRIM28重組質粒和可誘導穩(wěn)定表達TRIM28-

5、HEK293細胞系。將pcDNA5-TRIM28重組質粒和pOG44質粒共轉染入HEK-293細胞系中，用潮霉素B篩選陽性克隆。經(jīng)Western blot技術檢測發(fā)現(xiàn)，在轉染了空載體的對照組Flp-InTMT-RExTM-293細胞系中，無論加DOX誘導還是未加DOX誘導，都不會檢測到TRIM28的表達。而在共轉染了pcDNA5-TRIM28重組質粒和pOG44質粒的Flp-InTMT-RExTM-293細胞系中，未加DOX誘導的一組同

6、樣檢測不到TRIM28的表達，而在加入適量DOX誘導的實驗組中，TRIM28明顯有較高水平的表達。通過分析結果可以進一步證明可誘導穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系構建成功。提取可誘導穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系蛋白質，進行雙向電泳和質譜鑒定，結果發(fā)現(xiàn)11個受TRIM28調(diào)節(jié)的蛋白質基因，其中上調(diào)基因有3個、下調(diào)基因有8個。根據(jù)雙向電泳中檢測出的TRIM28調(diào)節(jié)的11個靶基因設計引物，DOX誘導穩(wěn)定表達TRIM28-H

7、EK293細胞系，提取RNA，反轉錄后進行熒光定量PCR檢測;并在HeLa細胞系中過表達TRIM28，同樣進行熒光定量PCR檢測，分析結果發(fā)現(xiàn)部分驗證了雙向電泳的結果，TRIM28具有調(diào)控的作用，可上調(diào)或下調(diào)某些基因的表達。提取7種不同腫瘤細胞系RNA，經(jīng)反轉錄和熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-231細胞系、T47D細胞系、MCF-7細胞系、MDA-MB-435細胞系及HEK293細胞系中，TRIM28 mRNA的表達水平都顯著

8、升高，這表明TRIM28 mRNA的表達與腫瘤有關。收集了11例癌旁正常乳腺組織標本和33例乳腺腫瘤組織標本，提取組織標本RNA，通過熒光定量PCR檢測，分析熒光定量結果發(fā)現(xiàn)，與正常組織標本相比，在乳腺癌腫瘤組織標本中TRIM28 mRNA的表達水平顯著增高，約是正常組織TRIM28 mRNA表達的近4倍，這表明TRIM28的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關系。在具有內(nèi)源性表達TWIST1的4T1細胞系中過表達TRIM28，通過兩次的Wes

9、tern blot結果本實驗均發(fā)現(xiàn)，4T1細胞系過表達TRIM28后，與只轉染了空載體的對照組相比，TWIST1的蛋白表達水平明顯升高。通過蛋白質灰度分析發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM28后，兩次試驗結果TWIST1蛋白水平表達都增高，分別是對照組的1.28倍和1.71倍。TWIST1是調(diào)控腫瘤發(fā)生的重要基因，過表達TRIM28后TWIST1表達相應升高，表明在腫瘤中，TRIM28的表達與TWIST1的表達具有相關性，TRIM28在腫瘤發(fā)生中起到

10、重要作用可能是通過調(diào)控TWIST1來進行的，TRIM28能夠穩(wěn)定TWIST1蛋白。為了進一步驗證在4T1細胞系中的實驗結果，本實驗又在HeLa細胞系中過表達TRIM28，通過熒光定量PCR檢測及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，TRIM28提高了HeLa細胞系中TWIST1的蛋白表達水平，mRNA水平的表達反而降低。
　　結論:成功建立可誘導穩(wěn)定表達TRIM28-HEK293細胞系;通過雙向電泳和熒光定量PCR技術發(fā)現(xiàn)并檢測受TR