LIN28B在結(jié)腸癌中的表達及其與預(yù)后相關(guān)性研究.pdf

1、背景與目的：
　　 近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢。其中，結(jié)腸癌的發(fā)病率上升尤為顯著。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多基因多階段，深入研究其關(guān)鍵分子機制為新藥開發(fā)和臨床治療具有極大的社會價值和現(xiàn)實意義。
　　 LIN28B是近年新發(fā)現(xiàn)的一個與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新基因，其異常表達可促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，它編碼一種具有冷休克結(jié)構(gòu)域和反轉(zhuǎn)錄病毒型鋅指結(jié)構(gòu)

2、的胞漿蛋白，在秀麗隱桿線蟲中最先發(fā)現(xiàn)，參與維持干細胞“干性”，位于6q21，長度為752個堿基，GeneBank編號為NM001004317。LIN28B蛋白在胚胎干細胞和發(fā)育組織中高表達，隨細胞分化而逐漸低表達，在腫瘤組織中則反常高表達。LIN28B實質(zhì)為一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，大小為27kDa，在肝細胞癌中首先得到克隆，能夠在肝細胞癌中高表達并和細胞過度增殖相關(guān)。目前，LIN28B被認為是“癌胚基因”，可促進細胞惡性轉(zhuǎn)化并特異

3、高表達于部分進展期腫瘤，如肝細胞癌和結(jié)腸癌。國內(nèi)外研究認為LIN28B主要通過抑制非編碼的let-7microRNA家族來實現(xiàn)其促癌作用。
　　 miRNA是近年來的研究熱點，是非編碼RNA中的一員，不編碼蛋白，但能在轉(zhuǎn)錄后降解或抑制靶mRNA翻譯而實現(xiàn)基因沉默作用。和蛋白編碼基因一樣，miRNA基因的最終表達也受到基因組DNA拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳機制調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后生物加工過程這三個層次的調(diào)控。LIN28B通過抑制let-7

4、miRNA家族轉(zhuǎn)錄后加工成熟來實現(xiàn)其促癌作用。let-7家族于1993年首次在人基因組中被發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織包括結(jié)腸癌中該家族均低表達。let-7家族通過靶向K-RAS、HMGA2、c-Myc、LIN28B及Bcl-xL等癌基因以及E2F2、CCND1/2等細胞周期相關(guān)蛋白來實現(xiàn)腫瘤抑制作用。相反，miR-21高表達于多種腫瘤包括結(jié)直腸癌，其靶基因包括PTEN、PDCD4等抑癌基因。目前，let-7和miR-21被認為分別是經(jīng)典的抑癌和

5、促癌miRNA。不僅如此，它們還被證明與腫瘤細胞化療耐藥相關(guān)。有趣的是，最新的研究證明let-7家族和miR-21共同參與了炎癥促進結(jié)腸腺癌發(fā)生的正反饋信號環(huán)路。在該環(huán)路中，LIN28B在pri-let-7轉(zhuǎn)錄后多層次抑制其表達，同時let-7也可靶向沉默LIN28B，形成負反饋。LIN28B可由轉(zhuǎn)錄因子c-Myc激活，據(jù)前述c-Myc也是let-7的靶基因，但c-Myc高表達又能通過激活LIN28而下調(diào)let-7。因此，LIN28B和

6、let-7之間形成復(fù)雜的相互對抗關(guān)系。在這個信號環(huán)路中，miR-21位于LIN28B和let-7的下游，但其也通過PTEN間接激活了NF-κB而參與了該正反饋的維持。
　　 另一方面，大量研究認為腫瘤干細胞具有成體干細胞的特點。LIN28/let-7環(huán)路調(diào)控ALDH1陽性腫瘤干細胞的“干性”，LIN28和OCT4則與卵巢癌干細胞相關(guān)。反之，Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)

7、能通過LIN28/let-7環(huán)路而抑制胃癌轉(zhuǎn)移發(fā)生。綜上，LIN28B非?？赡軈⑴c結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。
　　 轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的兩個最主要的死亡原因，最新研究結(jié)果表明，在結(jié)腸癌中LIN28B高表達與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)。化療是目前結(jié)腸癌綜合治療中的重要一環(huán)。奧沙利鉑是結(jié)腸癌化療的一線用藥，但結(jié)腸癌細胞對奧沙利鉑的耐藥性嚴(yán)重影響化療效果，研究其內(nèi)在機制有助于提高化療效果并降低結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。
　　 RNA

8、干擾是近年來興起的新技術(shù)，它可以通過短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)與體內(nèi)靶mRNA結(jié)合，從而產(chǎn)生序列特異性基因沉默，該方法目前成為研究基因功能及篩選分子靶向藥物的良好工具。截至目前國內(nèi)尚無LIN28B在結(jié)腸癌組織中的表達情況及其與病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等病理特點及生存復(fù)發(fā)情況關(guān)系的報道。此外，國內(nèi)外關(guān)于結(jié)腸癌細胞中LIN28B基因表達及其與奧沙利鉑化療敏感性的研究尚屬空白。本研究第一部分利用EnVisi

9、on免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測美國Biomax結(jié)腸癌組織芯片(208例結(jié)腸癌，8例正常組織)和南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院149例手術(shù)切除石蠟切片中LIN28B的表達并進行染色評分，采用卡方檢驗比較不同LIN28B表達水平和結(jié)腸癌臨床病理性特征之間的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗進行生存分析，采用Cox比例風(fēng)險模型進行結(jié)腸癌生存和復(fù)發(fā)的單因素和多因素分析，判斷LIN28B在結(jié)腸癌預(yù)后中的臨床價值。
　　 第二部分我

10、們構(gòu)建干擾LIN28B的shRNA質(zhì)粒(sh-LIN28B)，將其轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞(SW480、HCT116和Caco2細胞)，并設(shè)立對照組;采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot分別檢測結(jié)腸癌細胞中LIN28B在mRNA和蛋白水平的表達;采用CCK-8法檢測sh-LIN28B和奧沙利鉑化療協(xié)同作用，Transwell方法檢測處理后的結(jié)腸癌細胞遷移能力，了解抑制LIN28B對結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑化療敏感性的影響，

11、并對可能涉及的機制進行探討。
　　 方法：
　　 1.選擇美國Biomax的結(jié)腸癌及正常組織組合微陣列芯片，包含208例腫瘤和8例正常結(jié)腸組織的病理信息。208例結(jié)腸癌中男118例，女90例，年齡24～82歲，平均年齡54.8歲，高分化腺癌83例，中分化腺癌8例，低分化腺癌4例。Ⅰ期2例，Ⅱ期130例，Ⅲ期46例，Ⅳ期11例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移55例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移153例，伴遠處轉(zhuǎn)移11例，無遠處轉(zhuǎn)移197例。
　　

12、 2.選擇2003年1月至2004年12月南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院149例行手術(shù)切除的結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本。其中，男性患者88例，女性61例，年齡19～85歲，平均年齡56.9歲;高分化腺癌70例，中分化腺癌67例，低分化腺癌12例，原位癌1例;TNMI期25例，Ⅱ期65例，Ⅲ期42例，Ⅳ期16例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移97例，遠處轉(zhuǎn)移16例，無遠處轉(zhuǎn)移133例。
　　 3.所有標(biāo)本均詳細記載病人基本信息，記錄腫瘤TNM分期、

13、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移情況。兩組研究對象均將高、中分化腺癌歸入分化較好組，將低分化腺癌歸入分化較差組。
　　 4.采用EnVision免疫組化法檢測組織芯片和石蠟切片中LIN28B蛋白表達，由兩名病理科醫(yī)師在雙盲情況下對每個標(biāo)本進行染色評分。結(jié)果按照如下標(biāo)準(zhǔn)進行判斷:陰性為無色，陽性為細胞質(zhì)染色呈棕黃色。根據(jù)陽性染色細胞百分比計分:高倍鏡下每張切片選擇10個有代表性的視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞共計數(shù)1000個細胞

14、。0分為陽性細胞數(shù)小于或等于5％，1分為陽性細胞數(shù)10％～25％，2分為陽性細胞數(shù)25％～50％，3分為陽性細胞數(shù)大于50％，將0～2分計為低表達，3分為高表達。
　　 5.采用卡方檢驗比較不同LIN28B表達水平和結(jié)腸癌病理性特點包括組織分級、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　 6.采用Kaplan-Meier法及LogRank檢驗進行生存分析。采用Cox比例風(fēng)險模型，以(Forward:LR)法篩選變量

15、，進行結(jié)腸癌生存和復(fù)發(fā)的單因素和多因素分析。
　　 7.細胞培養(yǎng):人結(jié)腸癌細胞SW480、HCT116和Caco2，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5％CO2、飽和濕度的條件下連續(xù)培養(yǎng)。
　　 8.細胞轉(zhuǎn)染及奧沙利鉑處理:成功構(gòu)建干擾LIN28B的shRNA質(zhì)粒(sh-LIN28B)，將其轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細胞(SW480、HCT116和Caco2細胞)，并設(shè)立對照組;sh-LIN28B和NC質(zhì)粒采用脂質(zhì)體Lipo

16、fectamine2000進行轉(zhuǎn)染。細胞分組:(1)空白對照組(Con-A):未經(jīng)任何處理的人結(jié)腸癌細胞;(2)空載對照組(Con-B):即脂質(zhì)體對照組;(3)空載對照和奧沙利鉑組(NC+oxaliplatin);(4)sh-LIN28B和奧沙利鉑組(sh-LIN28B+oxaliplatin)。奧沙利鉑處理細胞4小時后換10％胎牛血清的RPMI1640。
　　 9.RT-PCR:取上述分組細胞采用定量RT-PCR方法進行mRN

17、A水平檢測。用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA;以cDNA為模板進行PCR擴增。
　　 10.Westernblot:取上述分組細胞進行蛋白水平檢測。
　　 11.細胞遷移實驗:在Transwell的上室中加入每孔150μl的細胞，加入含不同濃度奧沙利鉑的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，對照組為空白對照組。在對應(yīng)Transwell下室中加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后取出Transwell小室，擦

18、凈小室底部微孔濾膜上層的細胞，于顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞。計算方法為40倍光學(xué)顯微鏡下隨機計數(shù)3個視野的細胞，取平均值。
　　 12.CCK-8細胞增殖檢測:取上述分組細胞分別接種于96孔板，用不同濃度的奧沙利鉑孵育4h后更換為新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，在不同時間點，加入10μlCCK-8溶液孵育2小時，在酶標(biāo)儀上讀取各組吸光度值。
　　 結(jié)果：
　　 1.美國Biomax結(jié)腸癌組織芯片免疫組化結(jié)果顯示，L

19、IN28B表達0分57例(27.4％)，1分71例(34.1％)，2分56例(26.9％)，3分24例(11.5％)。其在結(jié)腸癌組織中表達高于正常結(jié)腸組織;在中國南方醫(yī)院結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本中LIN28B表達0分39例(26.2％)，1分56例(37.6％)，2分13例(8.7％)，3分41例(27.5％)。
　　 2.采用x2檢驗比較結(jié)腸癌組織芯片中LIN28B不同表達水平與臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示LIN28B的高表達均與腫瘤較

20、差分化、較高TNM分期(P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P＜0.001);而LIN28B較低的表達與中-高分化、TNMI-Ⅱ期相關(guān)。在結(jié)腸癌石蠟標(biāo)本中LIN28B的高表達亦與腫瘤較差分化(P=0.031)、較高TNM分期(P＜0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P＜0.001)。
　　 3.單因素和多因素預(yù)后分析結(jié)果顯示LIN28B表達情況(P＜0.001)是影響結(jié)腸癌患者

21、生存的獨立預(yù)后因素(OR=39.840)，LIN28B表達情況是影響結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)的獨立危險因素(OR=40.077)。
　　 4.在體外實驗中，RT-PCR和Westernblot結(jié)果證實SW480、HCT116和Caco2結(jié)腸癌細胞中均有LIN28B基因表達，其中HCT116細胞表達最弱，SW480細胞最強。因此我們以后的實驗均選擇這兩種細胞進行。
　　 5.RT-PCR和Westernblot結(jié)果顯示，特異性的干擾

22、shRNA表達質(zhì)粒(sh-LIN28B)(轉(zhuǎn)染后48h)在50nM和100nM的濃度下可顯著下調(diào)SW480和HCT116結(jié)腸癌細胞LIN28B的mRNA和蛋白表達。其中，SW480細胞中LIN28B的mRNA在兩組中分別下調(diào)約36％和70％;在HCT116細胞中兩組均為約90％。
　　 6.CCK-8結(jié)果顯示經(jīng)過奧沙利鉑處理48小時后，HCT116細胞的IC50值為6.09±1.42μg/ml，SW480細胞升高34.3％至8.

23、18±3.64μg/ml。提示SW480細胞較高的基礎(chǔ)LIN28B表達水平可能影響奧沙利鉑化療毒性。聯(lián)合轉(zhuǎn)染NC或sh-LIN28B和奧沙利鉑分別處理HCT116、SW480細胞，CCK-8結(jié)果顯示，相比于NC聯(lián)合轉(zhuǎn)染組，sh-LIN28B聯(lián)合奧沙利鉑處理組在轉(zhuǎn)染后96小時可顯著降低SW480和HCT116細胞生存分別達52.9％和50.0％，提示沉默LIN28B表達可促進SW480和HCT116結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑化療敏感性。
　

24、　 7.Transwell結(jié)果顯示相比于NC轉(zhuǎn)染組，sh-LIN28B顯著抑制SW480細胞的遷移(3個隨機視野，平均為49.4％)。
　　 結(jié)論：
　　 LIN28B表達與結(jié)腸癌病理特征密切相關(guān)，并在結(jié)腸癌進展中起重要作用，可作為預(yù)測結(jié)腸癌患者術(shù)后生存復(fù)發(fā)的指標(biāo)。沉默表達于結(jié)腸癌細胞的LIN28B，可顯著抑制結(jié)腸癌細胞的遷移能力并促進奧沙利鉑的化療敏感性。LIN28B基因沉默有望成為結(jié)腸癌輔助化療中新的分子靶向藥物靶

25、點。
　　 本研究的創(chuàng)新之處
　　 1.我們用免疫組化法檢測組織芯片和石蠟切片中LIN28B蛋白表達并評分。采用卡方檢驗比較不同LIN28B表達水平和結(jié)腸癌病理性特點之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)LIN28B在結(jié)腸癌組織中相比于正常結(jié)腸組織高表達，其高表達與腫瘤的低分化、TNMⅢ-Ⅳ期、結(jié)腸癌局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 2.采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗對結(jié)腸癌患者進行生存分析。采用Cox比例風(fēng)