重癥開放性眼球損傷視網(wǎng)膜病變及機制實驗研究.pdf

1、[背景]
　　隨著社會的發(fā)展和交通事故的增加，開放性眼球損傷的發(fā)生率逐年提高，而其中有2/3合并后極部視網(wǎng)膜損傷。在現(xiàn)代化戰(zhàn)爭中，眼部戰(zhàn)創(chuàng)傷中開放性眼球損傷中合并后極部視網(wǎng)膜損傷的病例也高達80-90％。引起職業(yè)性球內(nèi)異物傷的原因最常見是捶打金屬時飛濺的金屬碎屑打擊進入眼球。這與戰(zhàn)時爆炸碎片所致眼內(nèi)異物傷的致傷原理相似，都是飛行異物打擊眼球引起。開放性眼球損傷常合并眼內(nèi)容物流失，和后極部視網(wǎng)膜損傷嚴重，稱為重癥開放性眼球損傷，其預(yù)

2、后差，致盲率高。重癥開放性眼球損傷導致視功能障礙的機制及影響其預(yù)后的因素已成為研究的熱點。目前認為影響重癥開放性眼球損傷預(yù)后因素主要與視網(wǎng)膜的損傷有關(guān)，但對傷后視網(wǎng)膜改變的研究很少。合適的動物模型，和開放性眼球損傷后視網(wǎng)膜病變對視功能的影響都有待進一步研究。
　　為此，本實驗采用自制氣槍建立重癥開放性眼球損傷模型，對其病理學變化改變進行觀測，以視覺電生理(F-ERG)作為評價兔眼傷后視功能的指標，并通過對視網(wǎng)膜凋亡因素的觀察，探討

3、兔眼破裂傷后視網(wǎng)膜光感受細胞損傷機制，為臨床上研究重癥開放性眼球損傷治療提供理論病理依據(jù)。
　　[目的]
　　開放性眼球損傷常造成嚴重視力下降或視力喪失，損傷機制尚不十分清楚。本研究利用氣槍制做重癥開放性眼球損傷模型，觀察兔眼破裂傷后視網(wǎng)膜早期臨床表現(xiàn)、病理變化以及光感受細胞損傷機制。
　　[方法]
　　1、健康無眼疾新西蘭白兔48只。隨機分為正常對照、傷后1h、3h、6h、12h、24h共6組，每組8只。麻醉后

4、，用自制氣槍自角膜緣后向球內(nèi)射擊，形成重癥開放性眼球損傷動物模型。
　　2、于傷后1h、3h、6h、12h、24h時行傷眼視覺誘發(fā)電位檢查，評估視功能損傷后處死實驗兔，立即摘除眼球，行石蠟包埋。將包埋好的眼球標本，平行于視神經(jīng)矢狀軸且以其為平面的視網(wǎng)膜進行連續(xù)切片，后行HE染色、甲基綠-派羅寧-馬休黃(MG-P-MY)染色法行細胞RNA檢測、p53、bcl-2、細胞原位凋亡檢測。
　　3、HE染色組織切片行光鏡及超高倍顯微鏡

5、觀察(ACT-2000型超高倍顯微診斷系統(tǒng))。光鏡下觀察:RNA檢測、TUNEL法細胞凋亡、p53和bcl-2蛋白陽性表達圖像經(jīng)過高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(HPISA-1000)處理，定量分析視網(wǎng)膜組織中p53、bcl-2的表達及細胞凋亡情況。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，進行變量轉(zhuǎn)換，單因素方差分析和相關(guān)分析等統(tǒng)計學方法處理。
　　[結(jié)果]
　　1、臨床表現(xiàn)射釘擊傷兔眼后見傷眼結(jié)膜立即充血、水腫、角膜傷口可見房水溢出，虹

6、膜、晶體脫出，隨后15秒至1分鐘發(fā)生眼球內(nèi)出血自傷口處溢出。
　　2、眼電生理結(jié)果正常8只兔眼視網(wǎng)膜電圖b波振幅為103.5±16.841mv，實驗組1h、3h、6h、12h、24h所有傷眼ERG檢查b波振幅消失，呈熄滅型波型。
　　3、病理檢查HE染色光鏡及超高倍顯微鏡觀察:所有傷眼可見脈絡(luò)膜上腔出血，玻璃體內(nèi)可見大量紅細胞，視網(wǎng)膜脫離，偶見淺層鞏膜出血、睫狀體與鞏膜分離。1h～3h時視網(wǎng)膜感光細胞的錐桿層有碎裂改變，其它

7、結(jié)構(gòu)無明顯改變。6h～12h時視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層明顯空泡變性，神經(jīng)節(jié)細胞核少量固縮等明顯改變。24h時視網(wǎng)膜變薄、結(jié)構(gòu)紊亂不清。
　　4、MG-P-MY染色檢測細胞RNA表達情況對照組和1h組視網(wǎng)膜各層細胞內(nèi)均未見RNA陽性表達，3h組在內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細胞層有少量RNA陽性表達，6h內(nèi)核層陽性表達增多，外核層偶見陽性表達，12h陽性表達明顯，24h可見大量RNA陽性細胞。凋亡指數(shù)(AIP)統(tǒng)計結(jié)果示對照組與傷后1h組差別有顯著性(P

8、=0.033);傷后1h與3h組差別有顯著性(P=0.042);傷后12h與24h組比較無顯著性差別(P=0.570);其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　5、超高倍鏡下觀察對照組和1h組未見腫脹壞死細胞，3h時出現(xiàn)腫脹壞死細胞，6h腫脹壞死細胞數(shù)達高峰，12h組有所下降。各實驗組脹亡指數(shù)比較:對照組與1h組差別無顯著性(P=0.470)，1h組與24h組差別無顯著性(P=0.064)，3h與12h組差別無顯著性(

9、P=0.141);對照組與24h組（P=0.12）、3h與24h組（P=0.08）差別無顯著性，其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　6、凋亡細胞(RNA陽性)和腫脹壞死細胞的比較從其各占細胞總數(shù)的比例來看，在受傷6h以前(含6h)脹亡細胞所占的比例大于凋亡細胞;在受傷12h以后（含12h）凋亡細胞所占的比例要大于脹亡細胞，而且隨著時間的延長，腫脹壞死細胞有下降趨勢，而凋亡細胞在12h后雖小幅升高但趨于穩(wěn)定。

10、　　7、免疫組織化學對照組及各實驗組bcl-2均無明顯表達。p53在3h開始在內(nèi)、外核層及神經(jīng)節(jié)細胞層有少量陽性表達，6h～12h明顯增多，24h略有下降。細胞凋亡6h在神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)、外核層有少量表達，12h-24h染色陽性的細胞明顯增多。本試驗中:Bcl-2對照組與實驗各組差異均無顯著性（P＞0.05）;正常視網(wǎng)膜組織細胞未見p53表達，對照組與傷后1h組差別無顯著性P=0.053，與傷后3h、6h、12h、24h之間的比較差異極顯

11、著(P＜0.01);傷后6h和24hp53蛋白的表達無顯著性(p=0.807);視細胞凋亡在傷后6h出現(xiàn)，方差分析，對照組與傷后1h組差別無顯著性(P=0.062)，對照組與傷后3h差異具有顯著性(P=0.005)、與6、12、24h之間的比較有極顯著差異性(P＜0.01);傷后12h和24h細胞凋亡的陽性表達無顯著性(P=0.628)。
　　8、細胞凋亡指數(shù)觀察對照組與傷后1h組差別無顯著性(P=0.019)，傷后1h與傷后3h

12、差異無顯著性(P=0.022)，傷后12h、24h之間的比較無顯著差異性(P=0.392);傷后3h、6h和12h細胞凋亡指數(shù)有有極顯著差異性(P＜0.01)。相關(guān)分析顯Bcl-2與p53及細胞凋亡無明顯關(guān)系，而p53與細胞凋亡存在顯著相關(guān)（P＜0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1、本研究運用制重癥開放性眼球損傷模型，傷情基本一致，制做簡單、重復(fù)性好，便于對比研究，是理想的動物模型。
　　2、重癥開放性眼球氣槍損傷傷情非

13、常嚴重，光鏡下視網(wǎng)膜在6h出現(xiàn)明顯病理損害，12-24h即出現(xiàn)不可逆改變。
　　3、重癥開放性眼球損傷后3h視細胞內(nèi)即有RNA表達，傷后6h視細胞內(nèi)見TUNEL陽性細胞，視細胞內(nèi)RNA表達與視細胞凋亡密切相關(guān)，用于反映視細胞凋亡情況時較TUNEL法更早、更敏感。
　　4、MG-P-MY染色結(jié)合超高倍鏡觀察，可準確分辨正常、凋亡和腫脹壞死細胞，為研究視網(wǎng)膜損傷時凋亡和腫脹壞死的情況提供了一個可靠、直觀、快速的方法。