眼球破裂傷視網(wǎng)膜病變的實驗研究.pdf

1、背景和目的:眼球破裂傷常造成嚴(yán)重視力下降或視力喪失，損傷機(jī)制尚不十分清楚。本研究利用汽槍槍彈制做兔眼球破裂傷模型，觀察兔眼球破裂傷后視網(wǎng)膜早期的臨床表現(xiàn)、病理變化，并初步分析眼球破裂傷后視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)RNA的表達(dá)情況、視網(wǎng)膜細(xì)胞的凋亡情況和視網(wǎng)膜細(xì)胞的腫脹壞死情況。 材料與方法:健康無眼疾新西蘭白兔48只，眼前段及視網(wǎng)膜檢查正常，體重為2.5～3.0kg。隨機(jī)分為正常對照、傷后1h、3h、6h、12h、24h共6組，每組8只。家兔

2、麻醉后，用自制汽槍自兔耳根后緣與眼球正中連線的角膜緣內(nèi)1mm沿角膜平面射擊，汽槍子彈從面鼻根部射出，形成眼球破裂傷模型。于傷后1h、3h、6h、12h、24h處死實驗兔，立即摘除眼球。切除角膜后以4％多聚甲醛磷酸緩沖液固定24h，逐級酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋備用。將包埋好的眼球標(biāo)本，平行于視神經(jīng)矢狀軸且以其為平面的視網(wǎng)膜進(jìn)行連續(xù)切片6張，切片厚度為4μm，每2張分別行HE染色、甲基綠-派羅寧-馬休黃(MG-P-MY)染色法行細(xì)胞R

3、NA檢測、TUNEL法細(xì)胞原位凋亡檢測。HE染色和MG-P-MY染色組織切片行光鏡及超高倍顯微鏡觀察(ACT-2000型超高倍顯微診斷系統(tǒng))。光鏡下觀察：MG-P-MY染色RNA陽性表達(dá)和TUNEL細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)圖像經(jīng)過高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(HPISA-1000)處理(每張切片取4個視野)，計算視野中陽性染色的細(xì)胞數(shù)，分析視網(wǎng)膜組織中RNA陽性和TUNEL陽性細(xì)胞情況。應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，單因素方差分析和

4、相關(guān)分析。 結(jié)果:1.臨床表現(xiàn)汽槍彈擊傷兔眼后見傷眼球結(jié)膜立即充血、水腫、角膜傷口可見房水溢出，虹膜、晶體脫出，1分鐘內(nèi)見球內(nèi)出血自傷口處溢出。 2.病理檢查HE染色光鏡及超高倍顯微鏡觀察：所有傷眼可見脈絡(luò)膜上腔出血，玻璃體內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，視網(wǎng)膜脫離，偶見淺層鞏膜出血、睫狀體與鞏膜分離。1h～3h組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的錐桿層有碎裂改變。6h～12h組見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹、固縮等改變，視網(wǎng)膜內(nèi)核層明顯空泡變性。24h組視網(wǎng)膜變薄

5、、結(jié)構(gòu)紊亂。 3.MG-P-MY染色檢測細(xì)胞RNA表達(dá)情況對照組和1h組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞內(nèi)均未見RNA陽性表達(dá)，3h組在內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有少量RNA陽性表達(dá)，6h內(nèi)核層陽性表達(dá)增多，外核層偶見陽性表達(dá)，12h陽性表達(dá)明顯，24h可見大量RNA陽性細(xì)胞。對照組和各實驗組RNA陽性細(xì)胞比例以凋亡指數(shù)(AIP)表示。凋亡指數(shù)(AIP)統(tǒng)計結(jié)果：對照組與實驗各組經(jīng)方差齊性檢驗，方差不齊，經(jīng)平方根變量變換后，方差齊性檢驗(P＜0.01)

6、，方差齊；經(jīng)單因素方差分析，對照組與傷后1h組差別有顯著性(P=0.033)；傷后1h與3h組差別有顯著性(P=0.042)；傷后12h與24h組比較無顯著性差別(P=0.570)；其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。 超高倍鏡下觀察可見三種細(xì)胞：大小、形態(tài)正常核綠染的正常細(xì)胞；大小正常或變小淡紅染的凋亡細(xì)胞；細(xì)胞腫脹染色質(zhì)呈網(wǎng)狀綠染的壞死細(xì)胞。對照組和1h組未見腫脹壞死細(xì)胞，3h時出現(xiàn)腫脹壞死細(xì)胞，6h腫脹壞死細(xì)胞數(shù)

7、達(dá)高峰，12h組有所下降。對照組和各實驗組腫脹壞死細(xì)胞比例以脹亡指數(shù)(OI)表示。各實驗組脹亡指數(shù)比較：對照組與1h組差別無顯著性(P=0.470)，1h組與24h組差別無顯著性(P=0.064)，3h與12h組差別無顯著性(P=0.141)；對照組與24h組(P=0.12)、3h與24h組(P=0.08)差別無顯著性，其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。 凋亡細(xì)胞(RNA陽性)和腫脹壞死細(xì)胞的比較：從其各占細(xì)胞總數(shù)的

8、比例來看，在受傷6h以前(含6h)脹亡細(xì)胞所占的比例大于凋亡細(xì)胞；在受傷12h以后(含12h)凋亡細(xì)胞所占的比例要大于脹亡細(xì)胞，而且隨著時間的延長，腫脹壞死細(xì)胞有下降趨勢，而凋亡細(xì)胞在12h后雖小幅升高但趨于穩(wěn)定。 4.TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡對照組視網(wǎng)膜組織中未見凋亡細(xì)胞。實驗組傷后1h-3h組視網(wǎng)膜組織中僅發(fā)現(xiàn)極少凋亡細(xì)胞；傷后6h后在視網(wǎng)膜內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層凋亡細(xì)胞顯著增加；傷后12h-24h在內(nèi)核層可見大量凋亡細(xì)胞，外

9、核層也出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。對照組和各實驗組TUNEL陽性細(xì)胞比例以凋亡指數(shù)(AIT)表示。凋亡指數(shù)(AIT)統(tǒng)計結(jié)果對照組與實驗各組經(jīng)方差齊性檢驗，方差不齊，經(jīng)平方根變量變換后，方差齊性檢驗(P＜0.01)，方差齊；經(jīng)單因素方差分析，對照組與傷后1h組差別無顯著性(P=0.291)；傷后1h與3h差別無顯著性(P=0.101)；傷后12h與24h比較有顯著性差異(P=0.038)；其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。 凋亡指

10、數(shù)(AIP)與凋亡指數(shù)(AIT)的相關(guān)性分析：二者有明顯相關(guān)性，r=0.888(P＜0.01)。 結(jié)論:本研究運用汽槍制做眼球破裂傷模型，傷情基本一致，制做簡單、重復(fù)性好，便于對比研究，是眼球破裂傷理想的動物模型。眼球破裂傷傷情非常嚴(yán)重，光鏡下視網(wǎng)膜在6h出現(xiàn)明顯病理改變，12-24h視網(wǎng)膜損傷進(jìn)一步加重。傷后3h視細(xì)胞內(nèi)即有RNA表達(dá)，傷后6h視細(xì)胞內(nèi)見TUNEL陽性細(xì)胞，視細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)與視細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，用于反映視細(xì)胞