miR-145對VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖的影響及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分大鼠miR-145慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的：
　　 構(gòu)建針對rno-miR-145的慢病毒表達(dá)載體并鑒定其在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中是否過表達(dá)。
　　 方法：
　　 人工合成含有酶切位點粘端miR-145 shDNA雙鏈模板序列，克隆于LV3pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭載體中，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，收獲并濃縮慢病毒顆粒，同時構(gòu)建無關(guān)序列陰性對照載體(Scr

2、amble-NC)。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，并將細(xì)胞分為3組：正常對照組、miR-145組、miR-NC組。倒置熒光顯微鏡下觀察VSMC感染后的熒光表達(dá)情況，Real-time PCR檢測各組miR-145的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功構(gòu)建了miR-145慢病毒載體，測定病毒滴度為1×109TU/ml。
　　 (2)倒置熒光顯微鏡下觀察大鼠microRNA-145慢病毒表達(dá)載體感染

3、成功，MOI值為50，感染72h時感染率最高。
　　 (3)Real-time PCR結(jié)果顯示構(gòu)建的miR-145過表達(dá)慢病毒載體在感染目的細(xì)胞72小時后較空白細(xì)胞或陰性對照細(xì)胞表達(dá)豐度增加72.50倍(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)建立了高效穩(wěn)定表達(dá)rno-miR-145的慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
　　 (2)miR-145慢病毒載體感染VSMC后可高效的過表達(dá)，從而為進(jìn)一步研究miR-145在大

4、鼠VSMC中的作用提供理論依據(jù)。
　　 第二部分miR-145對VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖的影響
　　 目的：
　　 miR-145慢病毒載體感染大鼠原代VSMC，PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖，選擇3個VSMC表型標(biāo)志基因PCNA、c-Jun及SM22a，觀察miR-145對VSMC表型轉(zhuǎn)化和增殖是否有抑制作用。
　　 方法：
　　 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF(

5、10ng/ml)誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使VSMC轉(zhuǎn)化為去分化型（即獲得增殖能力），并將細(xì)胞分為4組：正常對照組、PDGF-BB(10ng/ml)組、PDGF-BB(10ng/ml)+miR-145組及miR-NC組。CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況；實時RT-PCR方法檢測miR-145過表達(dá)后對PCNA、c-Jun及SM22a mRNA水平的影響；Western印跡方法檢測miR-145過表達(dá)后對VSMC表型轉(zhuǎn)化標(biāo)志基因蛋白水平

6、的影響。
　　 結(jié)果：
　　 CCK-8結(jié)果顯示：與空白對照組相比，miR-NC組OD值無顯著差異(P＞0.05)；PDGF組OD值明顯升高(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組OD值明顯下降(P＜0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對照組比較，miR-NC組PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)；PDGF組PCNA、c-Jun mRNA的表達(dá)分

7、別上調(diào)37％(P＜0.05)和168％(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達(dá)下調(diào)80％(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組PCNA、c-Jun mRNA的表達(dá)分別下調(diào)66％和77％(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達(dá)上調(diào)335％(P＜0.01)。Western-blot結(jié)果顯示：與空白對照組比較，PDGF組PCNA、c-Jun mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)，而SM22a

8、mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組c-Jun、PCNA mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.miR-145可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖；
　　 2.miR-145可上調(diào)VSMC分化相關(guān)基因而下調(diào)增殖相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制VSMC的表型轉(zhuǎn)化。
　　 第三部分

9、miR-145通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制VSMC增殖
　　 目的：
　　 選擇絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)(MAPKs)家族的3個亞類：ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK，探討miR-145過表達(dá)對PDGF-BB誘導(dǎo)的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步分析miR-145是否通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制VSMC增殖。
　　 方法：
　　

10、 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF(10ng/ml)誘導(dǎo)VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化（即獲得增殖能力），并將細(xì)胞分為4組：正常對照組、miR-NC組、PDGF-BB(10ng/ml)+miR-145組及PDGF-BB(10ng/ml)組。Western印跡方法檢測ERK1/2和p-ERK1/2的表達(dá)、JNK和p-JNK的表達(dá)以及p38MAPK和p-p38MAPK的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 Western

11、-blot結(jié)果顯示：PDGF-BB(10ng/ml)誘導(dǎo)VSMC后，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK水平明顯上調(diào)，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-145干預(yù)72h后再加入PDGF-BB刺激，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK水平明顯下調(diào)，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)?？召|(zhì)粒組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 miR-14