IL-1β對體外培養(yǎng)MRC-5細胞增殖及表型轉化的影響.pdf

1、目的:
　　在哮喘的氣道重塑中，人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung fibroblast，HELF，MRC-5)活化后，發(fā)生細胞表型轉化，轉換成肌成纖維細胞，并特征性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。本研究通過外源性白介素-1β（IL-1β）刺激體外培養(yǎng)的MRC-5細胞，檢測細胞增殖、α-SMAmRNA和α-SMA蛋白水平，以及神經生長因子(nerve growth factor, NGF)的表達水平，

2、從而探討氣道重塑與氣道炎癥之間的相互調控關系。
　　方法:
　　本實驗采用體外培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞(MRC-5)，隨機分為實驗組和對照組。實驗分為兩個部分:(1)經不同濃度IL-1β刺激MRC-5細胞48h后，采用CCK-8法檢測細胞的增殖情況，半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)、Westernblotting檢測細胞表型轉化的標志物:α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的mRNA和蛋白水平。并收集細胞上清液，雙抗體夾

3、心ELISA(ABC-ELISA)法檢測NGF的表達水平。實驗組（分為A2、A3、A4、A5四個亞組）分別加入終濃度為0.1 ng/ml、1ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml的IL-1β;對照組(A1組)加等量培養(yǎng)液。(2)經IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間，同樣采用CCK-8法檢測細胞的增殖情況，半定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法(RT-PCR)、Western blotting檢測細胞表型轉化的標志物:α-平

4、滑肌肌動蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白水平。同時也收集細胞上清液，ABC-ELISA法檢測NGF的表達水平。實驗組（B組）加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，分為B1、B2、B3、B4四個亞組;對照組（C組）加入等量培養(yǎng)基，分為C1、C2、C3、C4組四個亞組分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h。
　　結果:
　　1.細胞形態(tài)學觀察:
　　1.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細胞的細胞形態(tài)學比較
　　

5、實驗組（分為A2、A3、A4、A5四個亞組）分別加入終濃度為0.1 ng/ml、1ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml的IL-1β，對照組(A1組)加等量培養(yǎng)液，在×100倍倒置顯微鏡下觀察48h后的細胞生長情況。發(fā)現對照組和低濃度組細胞呈有梭形、大多角形、扁平星形等，細胞核呈不規(guī)則的橢圓形或長方形，細胞突起粗短;隨著藥物IL-1β刺激濃度的增加，MRC-5細胞呈長條索狀，生長加快，細胞更加密集，呈渦旋狀、放射狀生長，細胞突起呈

6、細長絲狀（見圖1-5）。
　　1.2經IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間的細胞形態(tài)學比較
　　實驗組（B組）加入終濃度為10 ng/ml的IL-1β，分為B1、B2、B3、B4四個亞組;對照組（C組）加入等量培養(yǎng)基，分為C1、C2、C3、C4四個亞組分別培養(yǎng)0h、24h、48h、72h。鏡下發(fā)現隨著藥物IL-1β作用時間的延長，MRC-5細胞融合度更高，細胞密度更大，細胞突起更細長，B4細胞彼此之間結構紊亂

7、，甚至極性消失。
　　2.CCK-8法檢測細胞增殖
　　2.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細胞的OD值比較
　　A3組1.124±0.020，A4組1.149±0.017，A5組1.162±0.016的MRC-5細胞OD值，均明顯高于A1組1.015±0.031及A2組1.028±0.026，差異有統計學意義(P＜0.01)，而A2組與A1組無明顯差異(P＞0.05)。除A4組外，A5組明顯高于其他各組(P＜0.0

8、5)，A5組的細胞增殖程度相當于對照組A1組的1.1倍。說明IL-1β濃度依賴性地促進了MRC-5細胞增殖。
　　2.2 IL-1β10ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間點的OD值比較
　　應用CCK8法測定MRC-5細胞0h、24h、48h、72h的OD值，并繪制生長曲線（圖15）。B2組1.143±0.016，B3組1.162±0.016，B4組1.404±0.015分別高于C2組0.957±0.045，C3組1.01

9、5±0.031，C4組1.192±0.046;差異有統計學意義(P＜0.01)，即加用藥物IL-1β實驗組的細胞增殖速度，較相應時間點的對照組明顯加快。而且B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統計學意義(P＜0.01)，即隨時間的延長OD值逐漸增大，在72h達到高峰，說明IL-1β時間依賴性地促進了MRC-5細胞增殖。
　　3.RT-PCR法檢測MRC-5細胞的α-SMAmRNA表達情況
　　3.1不同濃度IL-1β

10、刺激MRC-5細胞α-SMAmRNA的表達結果
　　RT-PCR結果顯示，A3、A4、A5組所測灰度值(1.02±0.07、1.17±0.05、1.34±0.06)，均明顯高于A1組(0.59±0.04)及A2組(0.68±0.04)，差異有統計學意義(P＜0.01)，而A1組與對照組無明顯差異(P＞0.05)。A5組顯著高于A1、A2、A3組，差異有統計學意義(P＜0.05)，但與A4組無明顯差異(P＞0.05)。說明IL-1β

11、濃度依賴性地促進了MRC-5細胞的α-SMAmRNA的表達水平。
　　3.2 IL-1β10ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間點的α-SMAmRNA表達結果
　　B1組0.49±0.04、B2組0.66±0.04、B3組1.35±0.05、B4組1.65±0.05，C1組0.47±0.02、C2組0.50±0.03、C3組0.56±0.04、C4組0.63±0.05。在正常對照組的各個時間點，雖也有少量α-SMAmRNA表

12、達，但C1組、C2組、C3組和C4組共四組，各組之間無統計學差異(P＞0.05)。實驗組和正常對照組的相應時間點比較結果顯示:B2組高于C2組、B3組高于C3組、B4組高于C4組，差異均有統計學意義(P＜0.01)。隨時間的延長，α-SMAmRNA表達量逐漸增高，并在72h達到高峰，B4組的α-SMAmRNA表達量是B1組的3.4倍，另外B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統計學意義(P＜0.01)。說明IL-1β時間依賴性地促

13、進了MRC-5細胞的α-SMAmRNA的表達水平。
　　4.蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測α-SMA蛋白的表達情況
　　4.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細胞α-SMA蛋白的表達結果
　　實驗組A2組3.16±0.06，A3組5.05±0.13，A4組5.85±0.10，A5組6.36±0.13均明顯高于對照組A1組1.79±0.08，差異有統計學意義(P＜0.01)。A5組α-SMA蛋白的

14、表達水平最高，是A1組的3.6倍，且顯著高于A1、A2、A3組，差異有統計學意義(P＜0.01)。提示高濃度的IL-1β能較強刺激MRC-5細胞表達α-SMA蛋白的作用，即濃度依賴效應。
　　4.2 IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間點的α-SMA蛋白的表達結果
　　在正常對照組的各個時間點，也有少量α-SMA蛋白表達，但C1組0.19±0.02，C2組0.21±0.02，C3組0.24±0.03和C4組0

15、.25±0.02共四組，各組之間無統計學差異(P＞0.05)。實驗組和正常對照組的相應時間點比較結果顯示:B1組0.47±0.05和C1組1.06±0.05無統計學差異(P＞0.05); B2組1.06±0.05高于C2組、B3組1.79±0.04高于C3組、B4組1.92±0.04高于C4組，差異均有統計學意義(P＜0.01)。B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，差異有統計學意義(P＜0.01)，另外隨著作用時間的延長，α-SMA蛋

16、白表達量逐漸增高，并在72h達到高峰，B4組的α-SMA蛋白表達量較B1組增加了3倍，提示IL-1β時間依賴性地促進了MRC-5細胞的α-SMA蛋白的表達水平。
　　5.ABC-ELISA法檢測細胞上清液中NGF(pg/ml)的表達水平
　　5.1不同濃度IL-1β刺激MRC-5細胞上清液中NGF的表達水平
　　實驗組A3組59.57±4.11，A4組91.25±3.49，A5組92.59±5.10均明顯高于對照組A1

17、組44.18±2.71和A2組44.55±2.84，差異有統計學意義(P＜0.01)。但A2組與A1組差異無統計學意義(P＞0.05)。A5組NGF的表達水平最高，顯著高于A1/A2和A3組，差異有統計學意義(P＜0.01);但與A4組差異無統計學意義(P＞0.05)。提示高濃度的IL-1β能較強刺激MRC-5細胞分泌NGF的作用，即濃度依賴效應。
　　5.2 IL-1β10 ng/ml刺激MRC-5細胞不同時間點的上清液中NGF

18、的表達水平
　　在正常對照組的各個時間點，即C1組42.40±2.78，C2組42.90±3.39，C3組42.61±3.07和C4組42.57±3.09共四組，各組之間無統計學差異(P＞0.05)。實驗組和正常對照組的相應時間點比較結果顯示:B2組67.51±6.92高于C2組，B3組92.76±4.33高于C3組，B4組101.87±5.28高于C4組，差異均有統計學意義(P＜0.01)。B4組顯著高于B1組、B2組、B3組，