miR-145在硬皮病TGF-β-Smad3促纖維化通路中的作用及機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:硬皮病是一種以廣泛纖維化、血管改變和免疫異常為主要特點的自身免疫性疾病。硬皮病最常累及皮膚,引起膠原生成增加、細胞外基質(zhì)沉積增加。此外,還可累及肺臟、心臟、腎臟、消化道等內(nèi)臟器官,導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化、肺動脈高壓等嚴(yán)重并發(fā)癥,10年生存率約為60%~90%。由于其病因不明,暫無特效治療方法,特別是缺乏針對進行性纖維化的靶向治療。隨著對該病發(fā)病機制的深入研究,學(xué)者們認(rèn)為細胞外基質(zhì)生成增多是由成纖維細胞過度活化所致,在內(nèi)皮細胞、淋巴細

2、胞、巨噬細胞等細胞的互相作用下,通過細胞因子、趨化因子和生長因子等多種介質(zhì),成纖維細胞過度活化,形成惡性循環(huán)。闡明硬皮病的發(fā)病機制對于了解臨床分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后至關(guān)重要。
  皮膚和臟器進行性纖維化是硬皮病的主要病理生理過程,轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF)-β是其中的重要組成部分。TGF-β是成纖維細胞的強效趨化物,能使細胞外基質(zhì)合成增多(如Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原等),使成纖維細胞合

3、成纖連蛋白增多,調(diào)節(jié)細胞-基質(zhì)粘附蛋白受體,調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)生(如纖溶酶原激活物或膠原酶原)。通過自身誘導(dǎo),TGF-β能刺激成纖維細胞合成TGF-β,上調(diào)TGF-β受體的表達。TGF-β持續(xù)生成增多,引起細胞外基質(zhì)進行性沉積,進而導(dǎo)致纖維化。TGF-β主要通過Smad家族轉(zhuǎn)錄激活因子實現(xiàn)信號傳遞,其中Smad3與其關(guān)系最為密切。在活化的TGF-β刺激下,Smad3被TGF-β受體Ⅰ激酶磷酸化,繼而與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物,進入細胞核,與Sm

4、ad結(jié)合元件及轉(zhuǎn)錄因子相互作用,誘導(dǎo)編碼細胞外基質(zhì)的基因表達升高。
  microRNAs(miRNAs)是近年發(fā)現(xiàn)的一類約為22個核苷酸的非編碼RNA分子,與mRNA3’端非翻譯區(qū)種子序列配對,主要負(fù)向調(diào)控基因表達。如果配對完全或接近完全,靶mRNA將被完全降解。如果配對不完全,則與靶mRNA形成復(fù)合物,抑制mRNA的翻譯。最近數(shù)年間發(fā)現(xiàn)的miRNA呈指數(shù)增長,由人類基因組編碼的miRNA目前已超過千種。miRNA與多種自身免疫

5、性疾病的發(fā)病相關(guān),如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征和原發(fā)性膽汁性肝硬化。最新研究發(fā)現(xiàn),miRNA可能參與硬皮病發(fā)病機制,但其具體定位及其靶基因有待進一步探討。
  miRNA芯片技術(shù)是一種高通量miRNA篩查方法,可檢測患者與正常對照中miRNA的差異表達。本研究擬采用miRNA芯片技術(shù),篩選在硬皮病患者和正常人中差異表達的miRNAs,并通過生物信息學(xué)分析,尋找出與TGF-β/Smad促纖維化信號通路相關(guān)的miRNA,

6、并采用real-time PCR、免疫組化等試驗方法,從組織、細胞水平驗證目標(biāo)miRNA及其靶基因在硬皮病發(fā)病中的作用。開展本研究,有望為闡明miRNA在硬皮病發(fā)病機制中的作用提供實驗依據(jù),并為研發(fā)特異性抗纖維化靶向治療提供目標(biāo)miRNA。
  第一部分 miRNA在硬皮病患者皮膚中的差異表達
  目的:通過比較硬皮病患者與正常對照的miRNA表達譜,發(fā)現(xiàn)在硬皮病患者中具有差異表達的miRNAs。
  方法:采集7例硬

7、皮病患者與7例對照者的臨床資料和皮膚樣本,進行組織病理檢查,并采用miRNA芯片技術(shù)分析具有差異表達的miRNAs。
  結(jié)果:在7例硬皮病患者中,5例為彌漫性硬皮病,2例為局限性硬皮病,男性2例,女性5例,年齡為30~64歲,平均年齡49.0歲,平均病程16.6個月。對照組7例,其中男性4例,女性3例,年齡為21~58歲,平均年齡44.8歲。從硬皮病患者與對照者前臂取皮膚樣本,分別進行病理檢查、成纖維細胞培養(yǎng)和miRNA芯片分析

8、。硬皮病患者的皮膚病理檢查顯示膠原過度沉積和深部纖維化。經(jīng)miRNA芯片技術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)在彌漫性硬皮病患者中,表達差異的miRNAs共有42個,其中25個表達上調(diào),17個表達下降。在局限性硬皮病患者中,表達差異的miRNAs共有60個,其中42個表達上調(diào),18個表達下降。21個miRNAs在彌漫性硬皮病和局限性硬皮病中均有表達差異,其中13個上調(diào),8個下調(diào)。
  結(jié)論:硬皮病患者與正常對照的皮膚組織具有不同的miRNAs表達譜。

9、r>  第二部分 miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及機制研究
  目的:探討miR-145在硬皮病TGF-β/Smad3通路中的作用及其機制。
  方法:通過生物信息學(xué)方法篩選與TGF-β/Smad3通路相關(guān)的miRNA。采用real-time PCR檢測miR-145在硬皮病患者和正常對照者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中的表達,免疫組化、real-time PCR檢測Smad3蛋白和mRNA在硬皮病患

10、者和正常對照者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中的表達,real-time PCR檢測TGF-β刺激時硬皮病患者和正常對照者的皮膚成纖維細胞中miR-145和Smad3 mRNA的表達。
  結(jié)果:經(jīng)過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)Smad3 mRNA中含有miR-145結(jié)合的種子序列。對正常對照相比,miR-145在硬皮病患者的皮膚組織和皮膚成纖維細胞中表達均顯著降低(P<0.05),Smad3 mRNA在硬皮病皮膚組織和皮膚成纖維細胞中表達顯

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