MnC12對大鼠睪丸支持細胞ABP、Tf和INHB mRNA轉錄及蛋白表達的影響.pdf

1、目的:生殖健康是近些年討論的熱點，男性精液的質和量呈逐漸下降趨勢，其影響因素是多方面的，環(huán)境污染是重要影響因素。在中國，由于生產工藝和技術的落后，以及管理不善，環(huán)保觀念的薄弱，使得近些年的重金屬污染情況日趨嚴重。錳作為重金屬的一種，既是人體所需的微量元素之一，又是職業(yè)危害因素之一。錳參與人體的多種功能活動，微量的錳被機體吸收后，可進入睪丸組織參與精子的生成。錳缺乏時會出現性欲低下和不育，表現為生殖功能抑制，精子成熟受阻等；但過量的錳也會

2、對雄性生殖系統(tǒng)產生影響，現有的研究表明，過量的攝入錳會對雄性生殖系統(tǒng)造成損傷，使睪丸萎縮、精子數量減少、畸形精子數增加等。
　　 該實驗研究中，以原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細胞(SC)為模型，以氯化錳(MnCl2)為染毒物，用實時熒光定量PCR(real time Q—PCR)和Westernblot方法檢測MnCl2對支持細胞雄激素結合蛋白(ABP)、轉鐵蛋白(Tf)和抑制素B(INH B)的mRNA轉錄水平和蛋白表達量的影響，探討

3、MnCl2對雄性生殖功能影響的作用機制，為進一步研究Mn對雄性生殖系統(tǒng)的毒性提供理論支持。
　　 方法:
　　 1．支持細胞體外培養(yǎng)：選取18～20d的清潔級雄性Sprague Dawley大鼠，分離提取Sertoli細胞。
　　 2．Cell Counting Kit—8(CCK—8)法檢測細胞生長狀態(tài)：將Sertoli細胞以細胞濃度為2．0×104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每板接種6個復孔，在450 nm測

4、吸光度，繪制細胞生長曲線。
　　 3．MTT法確定染毒濃度：以1．0×10—2mol/L、1．0×10—3 mol/L、1．0×10—4 mol/L、1．0×10—5 mol/L、1．0×10—6 mol/L、1．0×10—7 mol/L、1．0×10—8mol/L、1．0×10—9mol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli細胞，培養(yǎng)24h，用酶標儀在492nm測量吸光度，確定染毒濃度。
　　 4．熒光實時定量PCR

5、法檢測ABP、Tf和INH B mRNA的表達量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli細胞，染毒24h，提取Sertoli細胞的總RNA進行逆轉錄后，檢測ABP、Tf和INH B mRNA的轉錄水平。
　　 5．Western blot法檢測ABP、Tf和INH B的蛋白表達量：以50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的MnCl2工作液染毒Sertoli

6、細胞，提取Sertoli細胞的蛋白，用Westernblot法檢測ABP、Tf和INHB的蛋白相對表達量。
　　 結果:
　　 1．細胞培養(yǎng)結果：通過兩步酶法，提取的SD大鼠支持細胞存活率達到95％以上，培養(yǎng)48 h后細胞基本完全鋪開，生長良好，經胰酶純化后Sertoli細胞純度達90％以上。
　　 2．CCK—8法測定結果：培養(yǎng)4～8 d的細胞數量相對比較穩(wěn)定，代謝旺盛，選擇培養(yǎng)至第5d的細胞進行研究。

7、　　 3．MTT法測定結果：檢測各染毒組處理24 h后的Sertoli細胞OD值，經計算，IC50=200μmol/L，選擇1/4 IC50、1/2 IC50和IC50，即50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L為染毒濃度。
　　 4．熒光實時定量PCR結果：各濃度組Sertoli細胞ABP、Tf和INH B mRNA均能持續(xù)表達，三者的mRNA轉錄水平在各染毒組均降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義。

8、>　　 5．Western blot結果：ABP蛋白相對表達量在各染毒組均降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；Tf的蛋白相對表達量在100μmol/L和200μmol/L兩個濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義；INH B的蛋白相對表達量在200μmol/L濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:氯化錳在該染毒劑量下可降低Sertoli細胞ABP、Tf和INH B mRNA轉錄及蛋白的表達水平，提示氯化錳可能通過抑制A