煙曲霉感染對(duì)HUVEC表達(dá)TF、vWF及細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、第一部分煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF及vWF的變化
　　 目的：通過(guò)建立煙曲霉菌絲感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical veinendothelial cell HUVEC)的體外模型，①觀(guān)察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)組織因子(tissue factor TF)和血管假性血友病因子(von Willebrand Factor vWF)的水平；②分別用細(xì)胞松弛素D、N-鈣粘蛋白單克隆抗體或地塞米松處理HU

2、VEC，觀(guān)察煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF和vWF的變化，以探討侵襲性曲霉病血管侵襲的機(jī)制。
　　 方法：接種于24孔板的HUVEC長(zhǎng)滿(mǎn)融合后，加入預(yù)先配置的濃度為1×105CFU/ml煙曲霉菌絲懸液，建立煙曲霉菌絲感染血管內(nèi)皮細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為六組，每組總反應(yīng)體積200μl，即①空白對(duì)照組：細(xì)胞不予任何刺激；②TNF-α組：細(xì)胞予TNF-α(濃度100 ng/ml)刺激；③煙曲霉菌絲組：煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/

3、ml；④細(xì)胞松弛素D組：HUVEC長(zhǎng)滿(mǎn)融合后，實(shí)驗(yàn)前10 min用細(xì)胞松弛素D溶液處理，加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(細(xì)胞松弛素D終濃度為70 nmol/L，煙曲霉菌絲懸液濃度為105 CFU/ml)；⑤N-鈣粘蛋白抗體組：HUVEC細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)融合，予濃度1∶100的小鼠抗人N-鈣粘蛋白單克隆抗體處理1 h后，加入配制好的煙曲霉菌絲懸液(煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)；⑥地塞米松組：地塞米松和煙曲霉菌絲同時(shí)加入(地塞米松濃度為10

4、-4mol/L，煙曲霉菌絲懸液濃度為105CFU/ml)。加入煙曲霉菌絲后，分別于共培養(yǎng)0、2、6、12、18 h終止實(shí)驗(yàn)以獲取細(xì)胞凍融液和2、6、12、18 h提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA法分別檢測(cè)TF、vWF濃度。
　　 結(jié)果：
　　 一、TF變化：除空白對(duì)照組外，各實(shí)驗(yàn)組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12、18 h與0 h比較均升高(P＜0.05)，而空白對(duì)照組則無(wú)明顯變化；各組間0 h的TF表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義；各實(shí)驗(yàn)組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12、18 h高于空白對(duì)照組(P＜0.05)；TNF-α組HUVEC的TF表達(dá)量在2、6、12 h分別為503.64±53.26ng/L、1272.60±186.38 ng/L、908.97±133.11 ng/L，明顯高于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的387.33±57.05 ng/L、523.56±74.26 ng/L、659.76±91.40 ng/L(P＜0.01)；細(xì)胞松弛素D組與煙

6、曲霉菌絲組比較，TF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-鈣粘蛋白抗體組的TF表達(dá)量在2、6、12 h分別為300.12±47.31ng/L、378.61±72.27ng/L、509.86±67.57ng/L，低于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的387.33±57.05 ng/L、523.56±74.26ng/L、659.76±91.40 ng/L(P＜0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組比較，HUVEC的TF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

7、義。
　　 二、vWF變化：與2 h比較，空白對(duì)照組和TNF-α組的vWF表達(dá)量在18 h增加(P＜0.05)，其余各組vWF表達(dá)量在6、12、18 h均增加(P＜0.05)；各實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組比較，除N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達(dá)量在2 h無(wú)明顯變化外，其余各時(shí)間點(diǎn)vWF表達(dá)量在2、6、12、18 h均升高(P＜0.05)；TNF-α組HUVEC的vWF表達(dá)量在2 h為64.45±7.58ng/mL，高于煙曲霉菌絲

8、組51.49±6.41 ng/mL(P＜0.05)，而在18 h為91.05±18.90 ng/mL，低于煙曲霉菌絲組133.73±19.49 ng/mL(P＜0.05)；細(xì)胞松弛素D組HUVEC的vWF表達(dá)量與煙曲霉菌絲組比較在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；N-鈣粘蛋白抗體組HUVEC的vWF表達(dá)量在2 h、6 h分別為38.95±6.26 ng/mL和61.99±5.41 ng/mL，低于煙曲霉菌絲組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的51.49±6.41n

9、g/mL和78.66±10.43 ng/mL(P＜0.05)；地塞米松組與煙曲霉菌絲組vWF表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：①建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型是可行的；②煙曲霉菌絲感染造成HUVEC損傷，過(guò)度表達(dá)TF和vWF；③細(xì)胞松弛素D對(duì)煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF及vWF無(wú)明顯影響；④N-鈣粘蛋白單克隆抗體可抑制煙曲霉菌絲感染后HUVEC表達(dá)TF及vWF；⑤地塞米松對(duì)煙曲霉菌絲

10、感染的HUVEC表達(dá)TF及vWF無(wú)明顯影響。
　　 第二部分煙曲霉菌絲誘導(dǎo)HUVEC凋亡
　　 目的：應(yīng)用煙曲霉菌絲感染HUVEC體外模型，觀(guān)察煙曲霉菌絲感染后HUVEC的凋亡情況。
　　 方法：建立煙曲霉菌絲感染HUVEC的體外模型(具體同第一部分)。實(shí)驗(yàn)分三組：①空白對(duì)照組，細(xì)胞不予任何刺激；②煙曲霉菌絲組Ⅰ(濃度105CFU/ml)③煙曲霉菌絲組Ⅱ(濃度106CFU/ml)。用流式細(xì)胞儀于2、4、8 h三個(gè)

11、時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)HUVEC凋亡率。
　　 結(jié)果：除空白對(duì)照組外，暴露于煙曲霉菌絲組Ⅰ和Ⅱ的HUVEC凋亡率在2、4、8 h逐漸增加(P＜0.05)；煙曲霉菌絲組Ⅰ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為9.76±1.47％、13.47±1.83％、20.08±2.36％，明顯高于空白對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的1.61±0.17％、1.72±0.16％、1.84±0.18％(P＜0.01)；煙曲霉菌絲組Ⅱ2、4、8 h的HUVEC凋亡率分別為12