電針刺OP大鼠后血清對(duì)離體成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA和蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過觀察針刺大鼠血清對(duì)離體培養(yǎng)的SD大鼠乳鼠成骨細(xì)胞OPG、RANKL mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探究針刺對(duì)骨代謝信號(hào)通路OPG/RANKL/RANK的作用，以期為針刺治療骨質(zhì)疏松癥提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：將60只SPF級(jí)雌性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、藥物組、針刺組，每組12只?？瞻捉M不予任何處理；假手術(shù)組只切開暴露雙側(cè)卵巢，但不摘除；模型組、藥物組、針刺組均采用外科手術(shù)摘除其雙側(cè)卵巢，飼養(yǎng)3個(gè)月后檢測(cè)骨密

2、度和骨礦物含量。空白組不予任何治療方法，正常飼養(yǎng)；模型組、假手術(shù)組除灌服與藥物組相同體積的蒸餾水外，正常飼養(yǎng)；藥物組以1mL/100g標(biāo)準(zhǔn)灌胃給予0．02mg/mL戊酸雌二醇片水溶液；針刺組選取穴位“三陰交”，“足三里”，“脾俞”，“腎俞”針刺，接入電針30min，同時(shí)灌服與藥物組同體積的蒸餾水。1次/d，連續(xù)治療5d，間隔2d，20d為1療程。治療3療程后檢測(cè)各組大鼠全身骨密度，判定治療效果。隨后，麻醉大鼠，經(jīng)心臟部位采血。血液經(jīng)4℃

3、冷置1h、離心(2500r/min，25min)、56℃水浴滅活、0.22um濾網(wǎng)抽濾除菌，得到效應(yīng)血清。取10只出生2d內(nèi)的SD大鼠乳鼠，分離顱骨后采用膠原酶消化法分離得到成骨細(xì)胞。原代成骨細(xì)胞進(jìn)行爬片培養(yǎng)24h后，將效應(yīng)血清以10％的比例（效應(yīng)血清：成骨細(xì)胞培養(yǎng)基=1:10）加入其中。培養(yǎng)3d后，以4%的多聚甲醛（原位雜交爬片采用含有1/1000 DEPC的多聚甲醛）固定各組爬片。成骨細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL mRNA的表達(dá)量采用原

4、位雜交法檢測(cè)；成骨細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL蛋白的表達(dá)量采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.SD大鼠切除雙側(cè)卵巢飼養(yǎng)3個(gè)月后，全身骨密度檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠全身骨密度和骨礦物含量均顯著低于空白組（P＜0.01），證明骨質(zhì)疏松癥模型建立成功。當(dāng)治療3個(gè)療程后，針刺和藥物治療均顯著提高了大鼠全身骨密度和骨礦物含量，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以針刺治療效果好。
　　2.成骨細(xì)胞內(nèi)OPG原

5、位雜交檢測(cè)結(jié)果：與空白組相比，模型組OPG mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，模型組OPG mRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)過藥物或針刺處理后，OPG mRNA表達(dá)量顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　3.成骨細(xì)胞內(nèi)RANKL原位雜交結(jié)果：與空白組相比，模型組RANKL mRNA表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，模型組RANKL mRNA表達(dá)量顯著上升（P＜0.

6、01）；經(jīng)過藥物或針刺處理后，RANKL mRNA表達(dá)量顯著降低，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　4.成骨細(xì)胞內(nèi)OPG免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果:與空白組相比，模型組OPG蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，模型組OPG蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；經(jīng)過藥物或針刺處理后，OPG蛋白表達(dá)量顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　5.成骨細(xì)胞內(nèi)RANKL免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果:

7、與空白組相比，模型組RANKL蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，模型組RANKL蛋白表達(dá)量顯著上升（P＜0.01）；經(jīng)過藥物或針刺處理后，RANKL蛋白表達(dá)量顯著降低，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：針刺治療能夠顯著提高大鼠全身骨密度和骨礦物含量，同時(shí)針刺大鼠效應(yīng)血清能夠明顯提高成骨細(xì)胞內(nèi)OPG mRNA，蛋白的表達(dá)量；同時(shí)，亦能降低成骨細(xì)胞內(nèi)RANKL mRNA，蛋白的表達(dá)量。本研究提示