玉米赤霉烯酮對大鼠睪丸支持細(xì)胞骨架及功能蛋白ABP等分泌的影響.pdf

1、玉米赤霉烯酮(ZEA)是由鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素，廣泛存在于動(dòng)物飼料和人類的食品中。研究表明，ZEA具有生殖發(fā)育毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致癌性。ZEA可以導(dǎo)致雄性動(dòng)物的雄激素分泌下降，雄性動(dòng)物雌性化和性欲降低，以及影響精子的生長發(fā)育，而睪丸支持細(xì)胞在生殖和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但是到目前為止，人們對ZEA的雄性生殖毒性仍缺乏全面的認(rèn)識，尤其是對ZEA的雄性生殖毒性的分子機(jī)理知之甚少。鑒于此，本研究通過建立ZEA與睪丸支

2、持細(xì)胞體外模型，檢測ZEA對支持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能蛋白分泌的影響，從分子水平上探討ZEA對睪丸支持細(xì)胞的毒性機(jī)理。
　　本試驗(yàn)以原代睪丸支持細(xì)胞為對象，通過胰酶和膠原酶的消化分離支持細(xì)胞，利用臺盼藍(lán)，油紅O以及FSHR免疫熒光對分離的細(xì)胞進(jìn)行活率和純度鑒定。本試驗(yàn)通過MTT法確定了ZEA的染毒濃度及染毒時(shí)間;通過激光共聚焦顯微鏡檢測ZEA對支持細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin，F(xiàn)-actin和細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響，利用透射電子顯微鏡

3、觀擦ZEA對支持細(xì)胞線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體等超微結(jié)構(gòu)的影響;利用QRT-PCR、Wester-blot、ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測ZEA對支持細(xì)胞ABP、Inhibin-β、FSHR、Vimentin、Transferrin和N-cadherin等功能蛋白分泌的影響。
　　1.睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定。采用胰蛋白酶和膠原酶對睪丸組織進(jìn)行二步消化，可以有效地分離到支持細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)染法測定細(xì)胞獲得的大鼠睪丸支持細(xì)胞活率在95％

4、以上;利用油紅O染色法和FSHR免疫熒光法對分離的睪丸支持細(xì)胞進(jìn)行純度鑒定，獲得的大鼠睪丸支持細(xì)胞純度在95％以上。
　　2.ZEA對睪丸支持細(xì)胞骨架及超微結(jié)構(gòu)的影響。MTT法確定本試驗(yàn)的ZEA染毒濃度為0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，染毒時(shí)間為24h;激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，隨著ZEA染毒濃度的升高，支持細(xì)胞α-tubulin和F-actin等骨架蛋白和細(xì)胞核的損傷程度加大，染毒組細(xì)胞核呈新月狀，形

5、式凹陷，嚴(yán)重可見核碎裂;透視電鏡觀察顯示，ZEA可以破壞支持細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，包括線粒體出現(xiàn)脊脫落甚至消失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)模糊、水腫和斷裂、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的空泡及脂肪滴破損。
　　3.ZEA對睪丸支持細(xì)胞功能蛋白分泌的影響。QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR的染毒組與對照組mRNA相比表達(dá)并沒有明顯的變化，而ABP、Vimentin、N-cadherin的mRNA表達(dá)與對照組相比都有不同程度的下降，其中ABP在10、20μg/mL下降顯著(

6、P＜0.05)，Vimentin和N-cadherin在20μg/mL染毒組下降顯著(P＜0.05），相反，Transferrin的mRNA表達(dá)隨著ZEA染毒濃度的增加，與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.01;P＜0.05)。Wester-blot結(jié)果顯示，與對照組相比，染毒組的ABP、FSHR、Vimentin、Transferrin、N-cadherin蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(P＜0.01;P＜0.05)。ELISA結(jié)果顯示

7、，與對照組相比，染毒組Inhibin-β和Transferrin的濃度都有有不同程度的下降，其中Inhibin-β在10和20μg/mL染毒組下降顯著(P＜0.05)，而Transferrin在20μg/mL染毒組下降顯著（P＜0.05）。
　　結(jié)論認(rèn)為，ZEA的雄性動(dòng)物生殖毒性可能與其對支持細(xì)胞骨架的破壞進(jìn)而影響了血睪屏障有關(guān)。ZEA可以影響支持細(xì)胞ABP、FSHR、Transferrin、Inhibin-β等功能蛋白的分泌，這