醋酸鉛對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞ABP、INH和TfmRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響.pdf

1、近年來(lái),環(huán)境污染已成為十分突出的問題,重金屬是其中一類重要的污染物。鉛是人類最早開始使用的重金屬元素之一,因其應(yīng)用廣泛,也造成了對(duì)環(huán)境的污染。鉛可對(duì)機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)和器官造成損傷,并影響動(dòng)物和人類的生殖功能。國(guó)內(nèi)外以往關(guān)于鉛雄性生殖毒性的研究主要集中在睪丸,因?yàn)椴G丸為雄性最主要的生殖腺,并且是大多數(shù)外源化學(xué)物雄性生殖毒性的靶器官。
　　支持細(xì)胞是雄性動(dòng)物睪丸曲細(xì)精管內(nèi)唯一的體細(xì)胞,在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。支持細(xì)胞離體培養(yǎng)模型由

2、于具有快速、經(jīng)濟(jì)、干擾少、實(shí)驗(yàn)結(jié)果針對(duì)性強(qiáng)以及結(jié)果的可靠性和重現(xiàn)性好等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于外源性毒物的生殖毒理學(xué)研究中。支持細(xì)胞被稱為生精細(xì)胞的“保姆細(xì)胞”,不僅在結(jié)構(gòu)上為生精細(xì)胞的分化成熟提供支架,供給生精過(guò)程所需的能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):同時(shí)可分泌數(shù)十種物質(zhì)參與生精細(xì)胞的分化成熟,具有精細(xì)的協(xié)調(diào)作用,保證精子發(fā)生的正常有序進(jìn)行。
　　支持細(xì)胞可分泌雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein,ABP)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(tr

3、ansferrin,Tf)和抑制素(inhibin,INH)等。ABP能夠轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存雄激素,使曲細(xì)精管內(nèi)維持高濃度的雄激素,生精細(xì)胞和精子均有結(jié)合和代謝ABP的能力;Tf可以為生精細(xì)胞提供生理活動(dòng)和生化過(guò)程所需要的鐵,并且對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有直接的刺激作用;INH能夠抑制卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)的分泌,不僅在調(diào)節(jié)垂體-睪丸軸的平衡中起著必不可少的作用,而且在睪丸精細(xì)胞分化、發(fā)育過(guò)程中起著直接

4、的作用。
　　ABP、Tf和INH均被廣泛地用作支持細(xì)胞功能的標(biāo)志。鉛能夠造成FSH的分泌異常,影響支持細(xì)胞內(nèi)第二信使的濃度,也能夠直接作用于支持細(xì)胞,影響支持細(xì)胞內(nèi)第二信使的生成。上述變化可能會(huì)影響到支持細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá),造成支持細(xì)胞分泌功能的異常,產(chǎn)生雄性生殖毒性。
　　本研究通過(guò)體外分離培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞,使其暴露于不同濃度的醋酸鉛,從mRNA水平上分析受試物對(duì)支持細(xì)胞表達(dá)ABP、INH和Tf的影響。以此探討支持細(xì)胞

5、在醋酸鉛造成的雄性生殖功能損傷中的作用,為進(jìn)一步研究鉛的生殖毒性作用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立大鼠睪丸支持細(xì)胞體外原代培養(yǎng)模型。18~21日齡SD大鼠睪丸經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶依次消化,分離和純化支持細(xì)胞。在35℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),并經(jīng)Feulgen染色進(jìn)行支持細(xì)胞鑒定。利用MTT法描述支持細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。以DMEM/F-12培養(yǎng)基為溶劑配制醋酸鉛工作液,給予不同劑量對(duì)支持細(xì)胞染毒24h,確定醋酸鉛最大無(wú)細(xì)

6、胞毒性作用劑量。
　　2.醋酸鉛對(duì)ABP、INH和Tf基因轉(zhuǎn)錄的影響。以醋酸鉛濃度為0 mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L對(duì)離體原代培養(yǎng)的大鼠睪丸支持細(xì)胞染毒24h,提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),以GAPDH為內(nèi)參照,檢測(cè)支持細(xì)胞內(nèi)ABP、INH和TfmRNA的水平。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。運(yùn)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(ana

7、lysis ofvariance,ANOVA)、Bonfferoni兩兩比較、Levene方差齊性檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05)。
　　結(jié)果:
　　1.本研究分離培養(yǎng)的支持細(xì)胞體外生長(zhǎng)良好,且支持細(xì)胞純度比較高,可以用于體外實(shí)驗(yàn)研究。不同濃度的醋酸鉛染毒體外培養(yǎng)第4d的支持細(xì)胞24h后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋酸鉛濃度最高為10-5mol/L時(shí)無(wú)細(xì)胞毒性。
　　2.RT-PCR結(jié)果:
　?、僖?0-8mol/

8、L~10-5mol/L的醋酸鉛染毒支持細(xì)胞24h,ABP mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組,但是差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　?、谝?0-8mol/L~10-5mol/L的醋酸鉛染毒支持細(xì)胞24h,TfmRNA在10-8 mol/L、10-7mol/L和10-6 mol/L劑量組的相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組,10-5 mol/L劑量組的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,但是各劑量組的基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.

9、05)。
　?、垡?0-8mol/L~10-5mol/L的醋酸鉛作用于支持細(xì)胞24h后,INH mRNA在10-8mol/L和10-7 mol/L劑量組的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10-6 mol/L劑量組的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,10-5mol/L劑量組的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,但是差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.醋酸鉛對(duì)原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞在10-8mol/

10、L~10-5mol/L劑量范圍內(nèi)未觀察到細(xì)胞毒性。
　　2.醋酸鉛在10-8mol/L~10-5mol/L劑量范圍內(nèi)對(duì)支持細(xì)胞雄激素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)無(wú)影響,醋酸鉛在此劑量下不影響雄激素結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白的分泌。
　　3.醋酸鉛在10-8mol/L和10-7 mol/L劑量下可減少支持細(xì)胞抑制素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。醋酸鉛在10-6 mol/L和10-5mol/L劑量下對(duì)抑制素的轉(zhuǎn)錄表達(dá)沒有影響。醋酸鉛可以改變抑制素的分泌,