單眼形覺剝奪大鼠視皮層NMDA-CREB級聯(lián)反應的研究.pdf

1、目的：
　　 人和哺乳動物出生后,視覺系統(tǒng)能夠根據(jù)視覺環(huán)境的刺激調整和改變與生俱有的神經(jīng)聯(lián)系和突觸結構。這一改變發(fā)生的最敏感時期稱為視覺發(fā)育可塑性關鍵期。在這個關鍵期內,由于各種原因導致眼部接受的有效光線刺激減少,使得矯正視力低于正常形成弱視。其中,在視覺關鍵期內,由于屈光間質混濁(角膜白斑或白內障),完全性上瞼下垂,造成單眼形覺剝奪更容易形成弱視。形覺剝奪性弱視一般為單眼性弱視。引起形覺剝奪性弱視的原因,既有單眼形覺剝奪因素,

2、也有雙眼異常相互作用因素。弱視的發(fā)病機理,一直是眼科學者們多年來研究和討論的熱點話題。
　　 目前已有的研究發(fā)現(xiàn),谷氨酸及其受體在弱視的發(fā)病機制中扮演著重要的角色,尤其是NMDAR1起著重要作用。NMDAR1是谷氨酸受體的一種主要亞型,為特異性離子通道,與配體結合后可以使神經(jīng)細胞膜對Ca2+的通透性增加,Ca2+大量進入細胞內,作為第二信使激活Ca2+依賴酶,引起細胞內生理效應的變化。NMDAR1與長時程增強和長時程抑制、學習、

3、記憶、突觸可塑性有關。NMDAR1在視皮質發(fā)育過程中可塑性的調控、成年后視皮層神經(jīng)元突觸聯(lián)系的可塑性的調節(jié)、誘導c-fos基因的表達、以及與蛋白激酶C的相互作用中都起重要作用。
　　 CREB在單眼視覺剝奪時可被激活,其對視覺優(yōu)勢柱的可塑性變化具有重要作用。有研究表明對于弱視動物模型進行HSV-mCREB治療,其視覺優(yōu)勢可塑性可以恢復。在神經(jīng)科領域里,NMDA-CREB級聯(lián)反應的激活,可以保護小腦顆粒細胞。鑒于NMDA和CREB

4、均與弱視的發(fā)病機制有關,我們擬研究這一級聯(lián)反應在弱視發(fā)病機制中的作用,在弱視的發(fā)病機制中CREB是以其磷酸化的形式pCREB在發(fā)揮作用,所以我們研究所選取的檢測指標為pCREB。
　　 左旋多巴是多巴胺的一種前體,它在通過血-腦屏障后轉化為多巴胺發(fā)揮作用。多巴胺參與了敏感期視皮質的發(fā)育,多巴胺及兒茶酚胺代謝可以解除弱視眼的皮質抑制,從而改善視功能。目前,左旋多巴已經(jīng)廣泛應用于臨床治療弱視并取得了初步成效。對其治療弱視的分子機制進

5、行探討,有助于闡明弱視的發(fā)生機制。
　　 我們首先制作單眼形覺剝奪動物模型,對形覺剝奪模型動物的電生理功能進行檢測并對其視皮質神經(jīng)元的超微結構進行觀察;接下來,我們對單眼形覺剝奪大鼠視皮質NMDAR1、pCREB分子表達水平進行檢測,并觀察左旋多巴對NMDAR1、pCREB表達的影響;第三部分,我們對正常動物及模型動物雙側視皮質中NMDAR1及pCREB的表達進行分子生物學檢測,并使用抑制劑進行干預,探討NMDA-CREB級聯(lián)反

6、應在單眼形覺剝奪弱視優(yōu)勢眼形成中的作用。
　　 方法：
　　 1、制作單眼形覺剝奪動物模型,14日齡SD大鼠幼鼠分為正常組與實驗組,實驗組腹腔注射麻醉后,封閉實驗眼,使上下瞼黏連形成單眼剝奪。對照組大鼠不做任何處理。兩組組大鼠分別在同等自然光照環(huán)境下飼養(yǎng)至45日齡。
　　 2、形覺剝奪動物模型的電生理研究,對兩組大鼠分別進行F-VEP檢查,測量P1波峰潛時和振幅,并進行比較。
　　 3、電鏡觀察視皮質神經(jīng)

7、元的超微結構,取實驗組及對照組大鼠封閉眼對側的視皮質,使用透射電鏡,觀察其超微結構。
　　 4、使用免疫組織化學,實時熒光定量PCR,蛋白免疫印記技術對45日齡的正常組及單眼形覺剝奪(MD)組動物視皮質中NMDAR1、pCREB的mRNA及蛋白表達進行檢測;自46日齡起,分別給予單眼形覺剝奪大鼠左旋多巴40mg/kg(LD組)和等體積生理鹽水(NS組)灌胃,每日1次,連續(xù)28天,對LD組、NS組鼠視皮質中NMDAR1、pCREB

8、的表達進行檢測,方法同前。
　　 5、制作單眼形覺剝奪動物模型,使用免疫組織化學、蛋白免疫印記的方法檢測正常組及MD組大鼠雙側視皮質中NMDAR1,pCREB的表達,分別使用鈣調蛋白激酶IV抑制劑KN-93(KN-93組)和生理鹽水(NS組)處理后,檢測KN-93組及NS組大鼠雙側視皮質NMDAR1,pCREB的表達,方法同前。
　　 結果：
　　 1、形覺剝奪動物模型的電生理研究,正常大鼠F-VEP呈現(xiàn)典型的N

9、PN波形,P1波峰潛時短,波峰陡直。形覺剝奪大鼠F-VEP檢測結果,P1波峰潛時明顯延長,波峰顯著降低。
　　 2、電鏡觀察單眼形覺剝奪動物視皮質神經(jīng)元的超微結構發(fā)現(xiàn):形覺剝奪動物視皮質中神經(jīng)元的超微結構受到破壞。損傷較重的神經(jīng)元核的形態(tài)尚存在,核周間隙擴展或核膜大部分崩解消失,胞質內容物也大部分崩解,殘存少量的粗面內質網(wǎng)及僅有少量扁平囊的高爾基復合體。線粒體腫脹,結構模糊。而正常組鼠視皮質中看不到這些變化。
　　 3、

10、單眼形覺剝奪大鼠視皮質中NMDAR1、pCREB的mRNA及蛋白表達均較正常組降低;左旋多巴處理后的模型大鼠視皮質中NMDAR1、pCREB的mRNA及蛋白表達較生理鹽水處理組升高。
　　 4、單眼形覺剝奪動物視皮質中剝奪側與非剝奪側NMDAR1及pCREB的表達,與正常組大鼠相比,形覺剝奪鼠非剝奪側視皮質中NMDAR1及pCREB表現(xiàn)為低表達狀態(tài),而剝奪側視皮質中NMDAR1及pCREB都表現(xiàn)為高表達狀態(tài)。
　　 5、

11、分別使用生理鹽水及鈣調蛋白激酶IV抑制劑KN-93處理后,兩組形覺剝奪模型大鼠視皮質中剝奪與非剝奪側NMDAR1的表達無明顯差異,而pCREB在KN-93組剝奪側視皮質中的表達明顯低于生理鹽水組,在非剝奪側的表達兩組無明顯差異。
　　 結論：
　　 1、單眼形覺剝奪使模型大鼠F-VEP的P1波峰潛時明顯延長,振幅顯著降低;
　　 2、單眼形覺剝奪使模型大鼠視皮質神經(jīng)元超微結構被破壞;
　　 3、單眼形覺剝

12、奪可以在轉錄或者轉錄上游的水平對視皮質NMDAR1、pCREB表達的產(chǎn)生影響;
　　 4、NMDAR1、pCREB與視覺發(fā)育的可塑性有關,左旋多巴能夠逆轉因形覺剝奪引起的NMDAR1、pCREB表達下降,這是其能夠改善視功能的分子機制之一,其作用部位在于視皮質;
　　 5、NMDA-CREB級聯(lián)反應參與了視覺敏感期優(yōu)勢眼的形成過程,其具體發(fā)揮作用的分子為NMDAR1、pCREB;
　　 6、鈣調蛋白激酶IV的抑制