正常和單眼形覺(jué)剝奪大鼠視皮層Neuritin mRNA和蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SYBRgreenI熒光定量RT-PCR方法和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)正常和單眼形覺(jué)剝奪大鼠視皮層NeuritinmRNA和蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)，研究Neuritin與視覺(jué)經(jīng)驗(yàn)和年齡的相關(guān)性，及形覺(jué)剝奪對(duì)其表達(dá)的影響，以期從分子水平探討Neuritin與視覺(jué)發(fā)育的相關(guān)性，為弱視的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。 方法： 1.健康Wistar大鼠50只，雌雄不限，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(天津)提供

2、，分為10組，每組5只，正常飼養(yǎng)，單眼形覺(jué)剝奪(MD)組于出生后第14天制作右眼形覺(jué)剝奪模型，分組情況：正常組分別為NP7、NP14、NP21、NP28、NP45和NP90組，MD組分別為MD21、MD28、MD45和MD90組。所有大鼠分別飼養(yǎng)至所需要的天數(shù)時(shí)麻醉、斷頭、取腦(MD組取左側(cè)視皮層腦組織)、提取總RNA，總RNA質(zhì)量和純度的檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，半定量PCR反應(yīng)，SYBRgreenI熒光定量RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后

3、用計(jì)算機(jī)將樣本與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，并結(jié)合內(nèi)參照得到大鼠視皮層組織NeuritinmRNA的相對(duì)表達(dá)量。各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行處理，相同時(shí)間段的兩組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，發(fā)育不同時(shí)限多組間比較采用單因素方差分析。 2.實(shí)驗(yàn)大鼠分組情況和單眼剝奪模型的制作同第一部分。大鼠分別飼養(yǎng)至所需要的天數(shù)時(shí)麻醉、灌注、固定、開(kāi)顱、冠狀切取后部腦組織，置于4％多聚甲醛固

4、定液中24-48h后，常規(guī)石蠟包埋。行4μn冠狀連續(xù)切片，行常規(guī)HE和免疫組織化學(xué)方法染色。顯微鏡下觀察Neuritin蛋白在視皮層中的表達(dá)情況。Olympus顯微攝像系統(tǒng)采集圖片，采用圖像分析軟件進(jìn)行累計(jì)光密度(IOD)值測(cè)定。對(duì)IOD值進(jìn)行分析和比較，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以-x±s表示，采用SPSS16.0處理數(shù)據(jù)，MD組與正常組間采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)，同組發(fā)育不同時(shí)限的IOD值采用單因素方差分析。 結(jié)果： 1.(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)

5、果：從溶解曲線圖可知大鼠視皮層Neuritin和內(nèi)參照GAPDHmRNA無(wú)論哪一種濃度的模板都能夠得到單一的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，無(wú)引物二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖的線性關(guān)系良好，在該實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量。(2)正常大鼠視皮層NeuritinmRNA表達(dá)：正常大鼠視皮層中NeuritinmRNA的相對(duì)表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)呈發(fā)育性變化，即睜眼前視皮層中就已存在，但含量很少，其相對(duì)表達(dá)值P7為0.152±0.011，隨后表達(dá)逐漸上

6、升，P14天為0.234±0.052，P21天為0.527±0.047，在P28天表達(dá)量達(dá)峰值，為0.846±0.067，后略有下降，P45天為0.445±0.020，至成年后維持于一定水平，其相對(duì)值為0.410±0.017，單因素方差分析各年齡段間NeuritinmRNA的相對(duì)表達(dá)差異具有顯著性(F=177.52，P<0.01)。(3)MD組大鼠視皮層NeuritinmRNA表達(dá)：MD21相對(duì)表達(dá)值為0.412±0.015，MD28相

7、對(duì)值為0.501±0.019，MD45相對(duì)值為0.381±0.030，MD90相對(duì)值為0.384±0.015，單因素方差分析各年齡段間NeuritinmRNA的相對(duì)表達(dá)量差異具有顯著性(F=36.93，P<0.01)。各個(gè)時(shí)間段MD組與正常組比較其相對(duì)表達(dá)量均有明顯減少，差異有顯著性(t21=5.262，P<0.01.t28=11.223，P<0.00、ts=3.970，P<0.01、t90=2.492，P<0.05)。 2.(

8、1)HE染色結(jié)果：正常發(fā)育組大鼠視皮層的神經(jīng)元分布呈層狀，從皮質(zhì)淺層至深層依次分為分子層、外顆粒層、外錐體細(xì)胞層、內(nèi)顆粒層、內(nèi)錐體細(xì)胞層和多形細(xì)胞層，各層神經(jīng)元排列整齊。MD組大鼠視皮層未見(jiàn)明顯異常。 (2)不同發(fā)育時(shí)限大鼠視皮層Neuritin的表達(dá)：光鏡下可見(jiàn)Neuritin的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀，主要位于神經(jīng)元細(xì)胞膜，神經(jīng)元胞體、胞核不被標(biāo)記。在視皮層各層均可見(jiàn)Neuritin陽(yáng)性顆粒。比較不同發(fā)育時(shí)限的正常組

9、NeuritinIOD值，可以看出正常發(fā)育組Neuritin的陽(yáng)性表達(dá)隨年齡呈發(fā)育性變化，P7Neuritin蛋白表達(dá)量很少，其IOD值為6.48±0.62，睜眼后表達(dá)量明顯增加P14天時(shí)其IOD值為14.56±2.37，P21天有明顯升高，達(dá)到23.36±4.28，P28天時(shí)達(dá)高峰，為67.94±5.98，隨后開(kāi)始下降，P45天時(shí)持續(xù)在較高水平，其IOD值為26.85±2.33。單因素方差分析各年齡段間Neuritin陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物差異

10、具有顯著性(P<0.05)。MD組Neuritin陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物明顯減少，表現(xiàn)為密度減低及數(shù)量減少。其IOD值在P21天為18.17±1.42(t=2.571，P<0.05)，P28為30.92±2.17(t=6.802，P<0.01)，P45為19.33±2.08(t=5.379，P<0.01)。 結(jié)論： 1.不同發(fā)育時(shí)限的大鼠視皮層組織中均有NeuritinmRNA表達(dá)，其表達(dá)的蛋白在視皮層各層均有表達(dá)，且兩者呈同步性