暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸蛋白基因的分離及表達(dá)分析.pdf

1、暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela Motschulsky），屬鞘翅目、金龜科，是分布廣泛的重要地下害蟲(chóng)。幼蟲(chóng)統(tǒng)稱(chēng)為蠐螬，主要為害花生、馬鈴薯、山藥等作物，其中花生因蠐螬危害一般減產(chǎn)10％～30％，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)60％～70％，甚至絕產(chǎn)，并造成花生品質(zhì)下降，嚴(yán)重制約著我國(guó)花生生產(chǎn)。昆蟲(chóng)圍食膜(Peritrophic membrane，PM)是昆蟲(chóng)天然的的物理屏障，是害蟲(chóng)防治的靶標(biāo)。因此分離鑒定新的靶標(biāo)蛋白基因及其表達(dá)分析

2、，為進(jìn)一步研究靶標(biāo)蛋白與殺蟲(chóng)活性物質(zhì)作用的分子機(jī)制和探索環(huán)境友好型殺蟲(chóng)劑控制蠐螬危害提供基礎(chǔ)。本研究通過(guò)構(gòu)建暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸cDNA文庫(kù)，利用免疫篩選文庫(kù)的方法，獲得了350個(gè)陽(yáng)性克隆，對(duì)其中3個(gè)編碼PM蛋白的cDNA進(jìn)行了分析，并初步研究了Cry8Ea3蛋白對(duì)hpcda5表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的影響。
　　提取暗黑鰓金龜（H.parallela）幼蟲(chóng)中腸總RNA，分離得到mRNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用Uni-ZAP XR載體，成

3、功構(gòu)建了高質(zhì)量的暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)中腸cDNA表達(dá)文庫(kù)。該cDNA文庫(kù)滴度為4.68×105pfu/mL，重組率為98.8％，擴(kuò)增后文庫(kù)滴度達(dá)1.8×108pfu/mL，插入cDNA片段的平均大小為1.8kb。用圍食膜蛋白多克隆抗體分別對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行免疫篩選，共得到350個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后生物信息學(xué)分析得到3個(gè)全長(zhǎng)基因hpcbp45、hpcda5、hpce19，分別編碼HpCBP45、HpCDA5和HpCE19蛋白。
　　分離獲得了編

4、碼圍食膜幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白的cDNA基因hpcbp45。該基因ORF為1923bp，編碼641個(gè)氨基酸。其編碼的蛋白HpCBP45 N-端具有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，預(yù)期蛋白分子量為69.5kDa，等電點(diǎn)為4.29。包含8個(gè)具有peritrophin-A結(jié)構(gòu)特征的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域(chitin binding domain，CBD)和3個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，氨基酸序列可以用通式CX13-20-CX5-CX9-CX12-CX7-C表示（X代表

5、除半胱氨酸之外的其他氨基酸殘基），其中多個(gè)CBD的存在有利于蛋白質(zhì)-幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。hpcbp45基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)了與預(yù)期一致的69.5kDa融合蛋白，在真核酵母表達(dá)系統(tǒng)中由于糖基化作用，表達(dá)的重組蛋白HpCBP45分子量約100kDa，高于預(yù)測(cè)分子量。幾丁質(zhì)結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)表明HpCBP45具有很強(qiáng)的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，只能被6M尿素和1％ calcofluor洗脫，屬于class3類(lèi)PM蛋白。實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示hpcb

6、p45基因在中腸中表達(dá)量最高，說(shuō)明該類(lèi)圍食膜是由中腸分泌，屬于TypeⅠ型PM。
　　分離得到編碼暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)羧酸酯酶的cDNA基因hpce19，該基因ORF為1605bp，編碼534個(gè)氨基酸，預(yù)期蛋白分子量為59.2kDa，等電點(diǎn)為4.19。經(jīng)NCBI網(wǎng)站Conserved Domain Database(CDD)分析表明，其編碼的HpCE19蛋白序列包含有Esterase/lipase superfamily（酯酶/脂肪酶超

7、家族）的保守結(jié)構(gòu)域。經(jīng)ExPASyProteomics Server網(wǎng)站ScanProsite分析，含羧酸酯酶B型絲氨酸活性位點(diǎn)FGGdpnkVtLaGySAG。ExPASy Proteomics Server網(wǎng)站SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，并經(jīng)Pfam網(wǎng)站分析其蛋白活性中心包括3個(gè)氨基酸殘基（催化三聯(lián)體:Ser203，Asp334，His438）。NetNGlyc1.0 Server預(yù)測(cè)在第257、408和448位氨基

8、酸分別含有N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。hpce19在畢赤酵母GS115中得到成功表達(dá)，表達(dá)59kDa左右的目的蛋白，與預(yù)期一致。以α-醋酸萘酯溶液為底物檢測(cè)HpCE19活性顯示平均酶活力為0.21 mmol/100μL酶液。實(shí)時(shí)定量PCR表明羧酸酯酶基因hpce19在中腸中表達(dá)量最高，推測(cè)與昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性相關(guān)。
　　篩選得到了編碼暗黑鰓金龜幼蟲(chóng)幾丁質(zhì)脫乙酰酶HpCDA5的cDNA基因hpcda5，該基因ORF為1107bp，編碼379個(gè)氨基

9、酸，預(yù)期蛋白分子量為42.2kDa，等電點(diǎn)為4.08;信號(hào)肽軟件分析發(fā)現(xiàn)N-端具有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列。氨基酸序列分析表明HpCDA5含有1個(gè)幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。Blast結(jié)果顯示其氨基酸序列與赤擬谷盜幾丁質(zhì)脫乙酰酶具有較高的相似性。hpcda5基因在原核細(xì)胞中獲得成功表達(dá)，表達(dá)約42kDa的目的蛋白。構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)載體pFastBac-hpcda5，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9，分別獲得P1、P2、P3病毒，檢

10、測(cè)P3病毒證明hpcda5在昆蟲(chóng)細(xì)胞sf9中獲得成功表達(dá)。幾丁質(zhì)結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HpCDA5蛋白具有幾丁質(zhì)結(jié)合活性。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示hpcda5基因在卵中表達(dá)量最高，在脂肪體和蛻中表達(dá)量較高，而在頭部則不表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)飼喂Cry8Ea3蛋白后hpcda5基因的表達(dá)變化，結(jié)果表明喂食Cry8Ea3蛋白后6h，hpcda5基因表達(dá)量顯著增高，8h之后恢復(fù)正常水平，表明飼喂Cry蛋白可以引起hpcda5基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)