暗黑鰓金龜幼蟲腸道微生物分子多態(tài)性及纖維素降解菌多樣性研究.pdf

1、從生態(tài)學(xué)和進化角度來說，腸道微生物對宿主昆蟲有著非常重要的作用。然而，腸道微生物種類和群落組成是否會隨著宿主昆蟲棲息地環(huán)境的變化而變化，目前鮮有報道，是值得深入研究的問題。本文研究了不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲后腸腸道細菌群落組成和多樣性，以及環(huán)境因子對腸道細菌群落組成和多樣性的影響。同時，采用好氧培養(yǎng)技術(shù)，從暗黑鰓金龜幼蟲后腸內(nèi)分離了具有纖維素酶產(chǎn)生能力的菌株，并從中克隆了纖維素酶基因，研究了腸道細菌對蠐螬的生理功能方面的作用。

2、　　 1.構(gòu)建了10個不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲腸道細菌的16S rRNA基因克隆文庫，并通過變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)分析歸類克隆子，挑取不同DGGE斑型(band type)對應(yīng)的克隆子測序。結(jié)果表明幼蟲腸道細菌可歸為205個操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)，分別屬于厚壁菌門(Firmicutes)，變

3、形菌門(Proteobacteria)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)。
　　 比較不同地理種群暗黑鰓金龜幼蟲腸道細菌群落及組成，可以發(fā)現(xiàn)以下幾個特征：
　　 (1)厚壁菌門和變形菌門細菌為腸道細菌優(yōu)勢細菌類群。厚壁菌門中的梭菌綱細菌廣泛存在于所有10個地理種群蠐螬腸道內(nèi)，且為腸道細菌絕對優(yōu)勢菌群。β-變形菌綱，γ-變形菌綱和ε-變形

4、菌綱的細菌也廣泛存在于10個地理種群樣本蠐螬腸道內(nèi)，只不過與梭菌綱細菌相比，所占比例較小。擬桿菌門，放線菌門和梭桿菌門細菌的分布則非常不均勻，在有些種群的蠐螬腸道內(nèi)有分布，有些種群腸道內(nèi)則沒有。
　　 (2)有6種OTUs代表的細菌遺傳型為所有地理種群的蠐螬所共有，在10個種群蠐螬腸道細菌克隆文庫內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)。其余的細菌遺傳型在地理種群樣本腸道內(nèi)則呈不均勻分布：很多細菌遺傳型只存在特定的地理種群蠐螬腸道內(nèi)，在其他種群的蠐螬腸道內(nèi)沒

5、有分布。
　　 (3)不同種群蠐螬腸道細菌群落多樣性存在很大差異：天津種群腸道細菌種類數(shù)最少，為38.8，而福建種群腸道細菌豐富度最高，細菌種類數(shù)為86.5?！?LIBSHUFF分析發(fā)現(xiàn)絕大部分種群腸道細菌克隆文庫組成之間存顯著性差異。
　　 (4)相關(guān)分析(Spearman nonparametric correlation test)和冗余分析(Redundancy discriminate analysis，RDA

6、)結(jié)果顯示，不同地理種群蠐螬腸道細菌群落組成和多樣性方面的差異，與宿主昆蟲棲息地環(huán)境條件密切相關(guān)。宿主昆蟲棲息的土壤理化條件(如土壤pH，土壤有機質(zhì)含量和土壤全氮量)，以及棲息地的氣候條件(年平均溫度，一月份最低溫和年降雨量)等環(huán)境因子，都可以顯著影響蠐螬腸道細菌多樣性和群落組成。
　　 2.從暗黑鰓金龜幼蟲后腸內(nèi)分離到207株纖維素降解菌。通過核糖體DNA擴增片段限制性內(nèi)切酶分析(Amplifed Ribosomal DNA

7、Restriction Analysis，ARDRA)分型后，結(jié)合代表菌株16S rDNA測序比對結(jié)果和生理生化試驗結(jié)果，所有這些纖維素降解菌可以歸為21種不同的細菌，分布在4個不同的門：變形菌門，放線菌門，厚壁菌門和擬桿菌門，其中，變形菌門細菌為纖維素降解菌中最優(yōu)勢的細菌類群。假單胞菌屬Pseudomonas，纖維菌屬Cellulosimicrobium，蒼白桿菌屬Ochrobactrum，根瘤菌屬Rhizobium和微桿菌屬Micr

8、obacterium為最主要的屬。而屬于芽孢桿菌屬Bacillus，發(fā)酵成對桿菌屬Dyadobacter，Siphonobacter屬，副球菌屬Paracoccus，Kaistia屬，德沃斯氏菌屬Devosia，Labrys屬，劍菌屬Ensifer，貪食菌屬Variovorax，Shinella屬，檸檬酸桿菌屬Citrobacter和寡養(yǎng)食單胞菌屬Stenotrophomonas的細菌也被分離得到，只不過所占比例較小。此外，在本研究中，

9、有一些種類的細菌，如Siphonobacter aquaeclarae，芬氏纖維微菌Cellulosimicrobium funkei，Paracoccus sulfuroxidans，弗氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii和硝化還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens都是首次被報道具有纖維素降解活性。
　　 3.本研究使用兼并引物同源克隆并結(jié)合染色體步移的方法，從1株暗黑鰓金龜腸道內(nèi)的纖維

10、素降解菌Rhizobium radiobacter基因組內(nèi)成功獲得2個纖維素酶編碼基因。其中1個基因為GH3家族的纖維素酶基因(暫命名celⅢ)，Blast結(jié)果顯示，celⅢ與來自Grosmannia clavigera kw1407的beta-glucosidase的相似性為60%。另1個基因?qū)儆贕H8家族的纖維素酶基因(暫命名celⅧ)，而BlastⅩ結(jié)果顯示，celⅧ編碼的蛋白與來自Agrobacterium sp.ATCC317