依博素生物合成基因ste7、ste26和ste27性質(zhì)功能的研究.pdf

1、鏈霉菌(Streptomyces)是在工業(yè)上常用的微生物之一，能產(chǎn)生大量的次級(jí)代謝物，主要有抗生素等，然而有關(guān)鏈霉菌胞外多糖的研究除本實(shí)驗(yàn)室外國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究室自行構(gòu)建了以基因重組白細(xì)胞介素—1(Interleukin—1，IL-1)可溶性受體為靶位的受體拮抗劑篩選模型，獲得了一種由鏈霉菌139產(chǎn)生的新型胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)依博素，經(jīng)藥效學(xué)研究證明依博素對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有明顯療效，有可能發(fā)展成為

2、臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的新藥。 依博素生物合成基因簇(ste)包含27個(gè)完整開放閱讀框(ORF)，已對(duì)不同基因的功能進(jìn)行深入研究。本文選擇了ste7、ste26和ste27基因作為研究對(duì)象。 根據(jù)同源性分析發(fā)現(xiàn)，ste7基因編碼的蛋白與不同來源的糖基轉(zhuǎn)移酶具有很高的同源性。為了確定ste7編碼產(chǎn)物的生化性質(zhì)，本研究在大腸桿菌中克隆表達(dá)了Ste7，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，酶學(xué)性質(zhì)研究證明Ste7為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠催化GDP

3、—巖藻糖中的巖藻糖轉(zhuǎn)移到單糖延長(zhǎng)鏈?zhǔn)荏w上，在依博素生物合成中起重要作用。該酶的Km值為36.87±3.04μM。 為了解ste26在依博素生物合成中的作用，對(duì)ste26進(jìn)行了同源重組雙交換基因阻斷實(shí)驗(yàn)，獲得了基因缺失株Streptomyces sp.139(ste26—)。與依博素相比，基因突變株產(chǎn)生的多糖衍生物EPS—26m的單糖組分不同程度有所變化；對(duì)IL-1R拮抗活性分析顯示，EPS—26m的活性沒有發(fā)生明顯變化，但EPS

4、—26m的峰位分子量明顯低于依博素。據(jù)此推測(cè)ste26可能在依博素生物合成過程中起修飾作用。 同源性分析顯示ste26基因編碼蛋白與乙酰轉(zhuǎn)移酶具有很高的同源性。為了解ste26編碼蛋白的生化性質(zhì)，本研究在大腸桿菌中對(duì)ste26進(jìn)行了克隆和表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，酶學(xué)性質(zhì)研究證明Ste26為精胺/精脒乙酰轉(zhuǎn)移酶，能夠催化乙酰輔酶A(AcCoA)中的乙?；D(zhuǎn)移到精胺、精脒和多聚賴氨酸上，具有一定的底物特異性。其中精胺是最適底物，酶

5、的Km為72.14±7.39μM、最適溫度為37℃、最適pH為7.5。 為了研究ste27在依博素生物合成中的作用，對(duì)ste27進(jìn)行了基因阻斷實(shí)驗(yàn)，獲得了基因突變株Streptomyces sp.139(ste27—)，其產(chǎn)生的多糖衍生物EPS—27m的單糖組分有所變化；與依博素相比，EPS—27m對(duì)IL-1R的拮抗活性沒有發(fā)生明顯變化；此外EPS—27m的峰位分子量明顯低于依博素。綜上所述，ste27基因的敲除對(duì)依博素生物合成

6、有所影響，但未導(dǎo)致其衍生物喪失活性，因此推測(cè)ste27可能在依博素生物合成中可能起修飾基因作用。 同源性分析顯示ste27基因編碼蛋白與乙酰轉(zhuǎn)移酶具有很高的同源性。為了解ste27編碼蛋白的生化性質(zhì)，在大腸桿菌中對(duì)ste27進(jìn)行了克隆和表達(dá)。酶學(xué)性質(zhì)研究證明Ste27為精胺/精脒乙酰轉(zhuǎn)移酶，能夠催化AcCoA中的乙酰基轉(zhuǎn)移到精胺、精脒、多聚賴氨酸和6—磷酸葡糖胺上，具有一定的底物特異性。其中精脒是最適底物，酶的Km為58.97±

7、2.47μM、最適溫度為28℃、最適pH為7.5。 為了獲得新型胞外多糖衍生物，更加深入了解ste26和ste27在依博素生物合成中的作用，利用同源重組雙交換法對(duì)ste26和ste27進(jìn)行了雙敲除，經(jīng)Southern blot驗(yàn)證，獲得了雙基因缺失株Streptomyces sp.139(ste26——27—)。與依博素相比，雙基因缺失株Streptomyces sp.139(ste26——27—)產(chǎn)生的胞外多糖衍生物EPS—2