新西蘭匍柄霉(Stemphylium eturmiunum)中與ASF1,STE2和STE3互作蛋白的篩選.pdf

1、匍柄霉屬(Stemphylium)是絲狀子囊真菌中的一類重要真菌類群，在自然界中該屬真菌絕大多數(shù)以無性態(tài)形式存在，但也有一小部分存在有性生殖階段，而新西蘭匍柄霉（Stemphylium eturmiunum）就是其中能產(chǎn)生有性態(tài)的種類之一。為了研究新西蘭匍柄霉（S.eturmiunum）與其它匍柄霉屬種在有性態(tài)進化方面的區(qū)別，我們查閱資料發(fā)現(xiàn)真菌的有性進化受若干性別相關因子的調(diào)控。研究表明，信息素受體基因STE2和STE3在模式菌釀酒酵

2、母、粗糙脈孢菌等菌中都有調(diào)控有性發(fā)育通路的作用。此外，反沉默因子ASF1對有性發(fā)育也有著一定的調(diào)控作用。研究表明，△STE2、△STE3和△ASF1單突變菌株在適宜的環(huán)境下培養(yǎng)均不能產(chǎn)生有性態(tài)。
　　真菌異宗配合發(fā)生在兩種細胞類型：a和α之間，細胞類型由分泌的信息素控制。兩種類型細胞分別能產(chǎn)生兩種信息素前體a和α，及兩種相應的信息素受體STE2和STE3。在有性生殖過程中，經(jīng)過加工的信息素α因子被a細胞表面的STE2受體識別，啟動

3、交配信號；同樣，經(jīng)過加工的信息素a因子被α細胞表面的STE3受體識別，啟動交配信號。為了進一步探索敲除信息素受體基因STE2和STE3后，是否影響其它上下游基因的表達，我們以新西蘭匍柄霉（S.eturmiunum）為實驗材料，主要進行了如下研究：利用Trizol法分別對△STE2和△STE3單突變菌株提取總RNA并進行轉錄組測序，結果表明敲除信息素受體基因STE2或STE3會影響其上下游一系列基因的正常轉錄。經(jīng)過分析與預測，我們從中選取

4、了一系列差異表達比較大的基因，試圖篩選信息素受體STE2和STE3的互作蛋白。通過基因序列的比對，我們發(fā)現(xiàn)STE2和STE3基因各含有一個內(nèi)含子。我們通過OverLap PCR獲得了沒有內(nèi)含子的基因序列，并在隨后的酵母雙雜實驗過程中，發(fā)現(xiàn)信息素受體STE2和ORF07010(糖苷水解酶家族32蛋白)能夠相互作用。
　　反沉默因子 ASF1( anti-silencing function1)在進化上非常保守，而且是組蛋白H3/H4

5、的分子伴侶，在基因轉錄、DNA復制和修復等多個染色質(zhì)層面的生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。通過同源序列比對，我們發(fā)現(xiàn)新西蘭匍柄霉(S.eturmiunum)基因組中含有ASF1基因。根據(jù)已報到的ASF1基因的信息，設計特異性引物克隆了新西蘭匍柄霉(S.eturmiunum)中的反沉默因子ASF1和組蛋白H3、H4的基因。同時利用酵母雙雜以及Pull-down實驗技術證明，ASF1確實能與組蛋白H4互作，但與組蛋白H3不存在相互作用，這可能