Sansanmycin生物合成基因族的克隆和生物合成調(diào)節(jié)基因ssaA調(diào)控機制研究.pdf

1、Sansanmycin(SS)是由我國貴州土壤中發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌Streptomyces sp.SS所產(chǎn)生的一組尿苷肽類抗生素，此類抗生素家族還包括pacidamycin，napsamycin和mureidomycin等。Sansanmycin對銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa，結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis及多重耐藥結(jié)核分支桿菌具有很好的抑制作用。Pacidamycin和napsa

2、mycin的生物合成基因簇已經(jīng)被克隆， pacidamycin基因簇中大部分生物合成酶的功能和生物合成步驟已經(jīng)基本闡明，但是關(guān)于它們生物合成調(diào)控機制尚未報道。
　　 本研究通過全基因組測序和構(gòu)建大片段基因組文庫相結(jié)合的方法首次克隆了sansanmycin的生物合成基因簇（ssa），其包含25個開放閱讀框，與pacidamycin和napsamycin的生物合成基因簇具有很高的序列相似性。利用HHpred對SsaA進行結(jié)構(gòu)同源性比

3、對分析，結(jié)果表明SsaA的N-端含有一個FHA(forkhead-accociated)結(jié)構(gòu)域，C-端含有一個LuxR類型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(helix-turn-helix，HTH) DAN結(jié)合模體，預(yù)示著ssaA可能是sansanmycin生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因。為了對ssaA的功能進行驗證，本研究將ssaA的編碼區(qū)克隆至含有強啟動子ermE*p的質(zhì)粒pL646中，通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入野生型菌株中構(gòu)建過表達(dá)菌株SS/pL-ssaA，生物學(xué)

4、活性檢測和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析結(jié)果表明sansanmycin的產(chǎn)量提高了約一倍，提示ssaA為sansanmycin生物合成正調(diào)節(jié)基因。為了對ssaA的調(diào)控功能進行進一步的確證，本研究采用PCR-targeting的方法構(gòu)建了ssaA的阻斷突變株SS/AKO，生物學(xué)活性檢測和HPLC分析結(jié)果表明，SS/AKO不產(chǎn)sansanmycin，而導(dǎo)入ssaA基

5、因可以使其恢復(fù)產(chǎn)生sansanmycin的能力，進一步確證ssaA為sansanmycin生物合成正調(diào)節(jié)基因。
　　 利用實時熒光定量RT-PCR對阻斷株SS/AKO中結(jié)構(gòu)基因ssaH，ssaN，ssaP，ssaX，ssaC的轉(zhuǎn)錄水平進行分析，結(jié)果表明SS/AKO中這些基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，說明ssaA是通過控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平從而控制sansanmycin產(chǎn)量。
　　 本研究利用E.coli BL21(DE3)表

6、達(dá)并純化了N-端融合了His標(biāo)簽的SsaA重組蛋白，進行凝膠阻滯實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)，結(jié)果表明SsaA可與基因簇內(nèi)包括ssaHp，ssaN-Pp，ssaU-Ap，ssaC-Dp，ssaWp在內(nèi)的多個結(jié)構(gòu)基因啟動子區(qū)結(jié)合，說明SsaA是通過直接結(jié)合于結(jié)構(gòu)基因的啟動子區(qū)從而控制sansanmycin的生物合成的。利用DNaseI足跡法獲得SsaA在這些啟動子區(qū)上的結(jié)合位點

7、，通過WebLogo對這些結(jié)合位點進行比對，獲得了SsaA的一致結(jié)合序列GTMCTGACAN2TGTCAGKAC，其特征為含兩個9 bp反向重復(fù)序列(inverted repeat,IR)，中間間隔2 bp。將一致結(jié)合序列進行突變和缺失，利用EMSA檢測SsaA與它們的結(jié)合能力，結(jié)果表明SsaA均不能和它們結(jié)合形成復(fù)合物，驗證了一致結(jié)合序列的正確性。
　　 當(dāng)EMSA實驗反應(yīng)體系中加入濃度逐漸升高的終產(chǎn)物sansanmycin

8、A(SS-A)或sansanmycin H(SS-H)時，SsaA與目標(biāo)基因啟動子區(qū)ssaC-Dp和ssaU-A-1p的結(jié)合能力逐漸減弱，表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)實驗顯示SS-A可以抑制SsaA與ssaC-Dp-3的結(jié)合，表明sansanmycin對SsaA的DNA結(jié)合活性具有調(diào)控作用。此外，SPR實驗表明SS-A和SS-H可以與SsaA直接相互作用，說明sansanmycin可通過