枇杷脫水素基因家族成員特性及抗凍功能研究.pdf

1、脫水素(Dehydrins)是植物體內(nèi)響應(yīng)細(xì)胞脫水反應(yīng)的一個(gè)基因家族蛋白，通常受低溫、高鹽、干旱等脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。枇杷（Eriobotrya japonica）是一種常綠果樹，在生長發(fā)育過程中經(jīng)常受到外界不利環(huán)境的影響，特別是由于枇杷在秋冬季節(jié)開花結(jié)果，幼果更是經(jīng)常受凍而影響果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)。本論文主要研究了枇杷脫水素基因（EjDHN）家族不同成員的特性、表達(dá)情況及其與枇杷抗凍能力之間的關(guān)系，試圖揭示EjDHN家族不同成員的表達(dá)響應(yīng)機(jī)制和可

2、能具有的功能。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR和RACE技術(shù)，從枇杷幼果中克隆到4種類型共7個(gè)脫水素基因，包括YnSKn類型的EjDHN1(Y2SK3)，SKn類型的EjDHN2(SK3)，EjDHN3(SK9)，EjDHN5(SK3)，EjDHN7(SK3)，Kn類型的EjDHN4（K4）和YnKn類型的EjDHN6(YK3)，各成員所編碼的蛋白的分子量大小、理化特性上均存在很大差異。成員間表達(dá)模式也不相同，

3、EjDHN5在各器官和組織中表達(dá)量都比較高，EjDHN4主要在花中表達(dá)，EjDHN2、EjDHN3、EjDHN6和EjDHN7主要在莖中表達(dá)。從各成員在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)情況來看，除EjDHN3外，其它家族成員都可能參與種子發(fā)育的調(diào)控，而EjDHN1，EjDHN2，EjDHN5可能與果肉的發(fā)育相關(guān)。EjDHN家族不同成員在葉片中的季節(jié)性表達(dá)變化趨勢基本一致，均在溫度最低的冬季表達(dá)量最高，說明這7個(gè)基因都受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。在干旱脅迫后，葉

4、片中7個(gè)EjDHN基因的相對表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升趨勢，其中EjDHN6表達(dá)量增幅最大。葉片中7個(gè)jDHN基因的表達(dá)對100μM ABA處理都有不同程度的響應(yīng)，以EjDHN6對ABA處理最敏感。推測EjDHN6在響應(yīng)干旱脅迫及ABA處理中起著重要作用。
　　2.為研究EjDHN基因在幼果抗凍脅迫中的作用，我們用凍害敏感型品種‘寧海白’和抗凍品種‘夾腳’的幼果進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示-3℃低溫脅迫導(dǎo)致枇杷幼果中氧自由基含量和膜脂過氧化程度顯

5、著增加，且凍害敏感型品種‘寧海白’的膜脂過氧化程度要比抗凍品種‘夾腳’嚴(yán)重的多。在枇杷幼果中，7個(gè)脫水素基因在低溫脅迫條件下都上調(diào)表達(dá)，且在‘夾腳’中的表達(dá)豐度都顯著高于‘寧海白’。金標(biāo)免疫定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低溫處理后脫水素蛋白主要在細(xì)胞膜附近積累，并且蛋白含量比處理前顯著增加，特別是在抗凍品種‘夾腳’中，其蛋白含量的增加尤為明顯。在低溫處理后，‘寧海白’細(xì)胞膜的破壞程度要比‘夾腳’嚴(yán)重，可能與低溫處理后‘寧海白’中脫水素蛋白的豐度較低

6、有關(guān)。以上這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫水素蛋白對枇杷幼果維持低溫脅迫后細(xì)胞膜的穩(wěn)定性具有重要作用。EjDHN基因的表達(dá)水平與不同品種枇杷的抗凍能力顯著相關(guān)。
　　3.為了進(jìn)一步研究EjDHN基因在枇杷抗凍中的功能，我們將EjDHN1和EjDHN5導(dǎo)入煙草中，共獲得7個(gè)EjDHN1超表達(dá)株系和22個(gè)EjDHN5超表達(dá)株系，然后各選擇表達(dá)水平比較高的兩個(gè)株系進(jìn)行功能研究。我們研究了轉(zhuǎn)EjDHN1和EjDHN5基因?qū)煵菘沟蜏睾脱趸{迫的影響。

7、結(jié)果表明，0℃低溫脅迫后，14d苗齡的野生型煙草苗的存活率要顯著低于轉(zhuǎn)基因植株，恢復(fù)生長2周后轉(zhuǎn)基因植株的生長情況要明顯優(yōu)于野生型。低溫處理導(dǎo)致6葉期野生型煙草苗的光合系統(tǒng)活性顯著降低，葉片膜脂過氧化程度增加，而轉(zhuǎn)基因煙草苗的受破壞程度要明顯輕于野生型。為了研究EjDHN1和EjDHN5對煙草抗氧化脅迫的影響，我們做了不同濃度梯度的甲基紫精（Methyl viologen，MV）脅迫試驗(yàn)。結(jié)果顯示，MV處理抑制了野生型和轉(zhuǎn)基因植株的生長