林煙草CBL基因家族成員NsylCBL10的功能分析.pdf

1、類(lèi)鈣調(diào)神經(jīng)素B亞基CBL(calcineurin B-like protein)是近年來(lái)報(bào)道的一類(lèi)植物所獨(dú)有的鈣感受器蛋白，在植物響應(yīng)高鹽、低鉀和干旱等非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。CBL基因家族在擬南芥、楊樹(shù)和水稻等植物中已有較廣泛的研究，但在煙草中至今未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用同源克隆的方法從林煙草（Nicotiana sylvestris）中獲得CBL家族基因NsylCBL10，并對(duì)該基因的氨基酸序列、基因組序列以及表達(dá)特性進(jìn)行了研究

2、，并通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證NsyICBL10參與鹽脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的作用。主要內(nèi)容有以下幾個(gè)方面:
　　(1)利用同源克隆的策略，從林煙草中獲得基因NsylCBL10(Genbank number: KF667488.1)，該基因CDS序列全長(zhǎng)為783 bp，編碼一個(gè)由260個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，并且該基因的氨基酸序列與擬南芥AtCB L10和楊樹(shù)PtCBL10相似性很高，共同位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的Ⅰ組中。NsylCBL10基因組序列全長(zhǎng)

3、為3857bp，含有8個(gè)內(nèi)含子、9個(gè)外顯子。
　　(2)將NsylCBL10蛋白的N端與GFP或DsRed2蛋白進(jìn)行融合，C端與GFP融合，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pGDG-NsylCBL10、pGDR-NsylCBL10和pCam-NsylCBL10，并注射本生煙，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡對(duì)注射部位的下表皮進(jìn)行觀察，結(jié)果表明NsylCBL10的N端融合熒光蛋白后主要分布于質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞中分布廣泛。NsylCBL10的C端融合

4、熒光蛋白后主要分布于細(xì)胞膜上。
　　(3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)NsylCBL10的組織表達(dá)情況進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)NsylCBL10在盛花期林煙草各組織器官中均有表達(dá)，其在腋芽中的表達(dá)量最高，其次為莖、花瓣、主根、葉和萼片，在側(cè)根中的表達(dá)量相對(duì)較低。
　　(4) NaCI處理時(shí),NsylCBL10表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)，表明NsyIC BL10可能參與植物響應(yīng)鹽脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。低鉀脅迫下，NsylCBL10的表達(dá)受抑

5、制，表達(dá)量下調(diào)，該結(jié)果與AtCBL10在低鉀脅迫下的表達(dá)情況一致。高溫和干旱脅迫下，NsylCBL10的表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢(shì)。表明NsylCBL10可能參與高鹽、低鉀、高溫和干旱四種脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。
　　(5)表型觀察和離子含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明在擬南芥中過(guò)表達(dá)NsylCBL10不僅能夠恢復(fù)擬南芥cbl10鹽敏感表型，并且通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)根部和地上部的Na+與K+的分布及均衡來(lái)提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高鹽脅迫的耐受能力。
　　(6)獲