小鹽芥功能基因組學的初步研究及AtNHX家族部分成員的功能分析.pdf

1、利用和開發(fā)大面積的鹽漬化土地是當今世界普遍關注的問題之一。利用傳統(tǒng)的育種方法來培育耐鹽作物雖然簡便可行，但進展緩慢。近年來植物基因工程的迅速發(fā)展為作物耐鹽性的提高帶來了新的契機。大多數(shù)植物，尤其是農作物對鹽脅迫是敏感的，因此挖掘和克隆具有我國知識產權的耐鹽基因，進行遺傳轉化，改良和提高作物的抗逆性，使得它們在鹽漬化土地上正常生長顯得尤為重要。本論文包括兩部分研究方向：構建了小鹽芥(The lungiella halophla)可轉化的B

2、IBAC文庫，轉化擬南芥來篩選耐鹽的轉基因植物；擬南芥AtNHX家族成員進行功能分析。 在構建了小鹽芥的BIBAC可轉化文庫的基礎上，轉化了擬南芥，獲得了轉擬南芥植株，建立了可轉化外源大片段DNA的轉化系統(tǒng)。結果表明這個可轉化文庫符合預期要求，共有23，040個克隆，插入片段長度在50-100kb之間，大約覆蓋了4倍小鹽芥的基因組。 通過對一個長83kb的BIBAC克隆的插入片斷的序列和擬南芥的基因組序列進行分析比較，發(fā)

3、現(xiàn)其中有24個潛在的基因，3個反轉座子。分析它們的基因結構發(fā)現(xiàn)，除了一個同源基因的外顯子個數(shù)不一樣以外，其它對應的擬南芥同源基因的外顯子個數(shù)都是一樣的；比較同源基因的序列發(fā)現(xiàn)它們在氨基酸或者核苷酸序列上面高度保守，說明它們在進化上面的保守性很高。對小鹽芥和擬南芥的共線性分析發(fā)現(xiàn)，它們的共線性程度很高。在小鹽芥上預測的基因都能在擬南芥對應的區(qū)域上找到對應的同源基因；這些基因在染色體上的排列順序和方向也是一致的。同時也發(fā)現(xiàn)一些染色體重排的現(xiàn)

4、象，如：倒位、插入、缺失。通過這些比較，我們一方面可以通過比較基因組學的方法對小鹽芥的這些潛在基因進行研究，另一方面可以利用擬南芥豐富的分子標記通過圖位克隆的方法克隆小鹽芥中的耐鹽基因。根據(jù)擬南芥AtNHX1的氨基酸序列比對可以確定AtNHX家族的其它5個成員AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6。根據(jù)它們氨基酸保守性和系統(tǒng)進化樹分析，可以將之分成兩組：AtNHX1、AtNHX2、AtNHX3、AtNHX4

5、；和AtNHX5、AtNHX6；通過對它們的基因結構分析也證明這一點。對染色體上的定位分析發(fā)現(xiàn)AtNHX1和AtNHX3,、AtNHX2和AtNHX4、AtNHX5和AtNHX6在同一染色體上面。在擬南芥中過量表達試驗發(fā)現(xiàn)，過量表達AtNHX4可以增加植物的耐鹽能力。通過轉啟動子-GUS植物的時空表達模式研究，發(fā)現(xiàn)在轉AtNHX2-GUS植物中整個生長發(fā)育期、成熟期都可以檢測到GUS表達。在轉AtNHX4-GUS植物中，只在維管束中表達

6、，尤其根部的維管束表達強烈。在轉AtNHX3-GUS植物中，只在種皮、兩片子葉以及花中檢測到GUS活性，其他時期均不表達。在4片葉子時對轉啟動子-GUS植物進行脅迫處理，結果發(fā)現(xiàn)AtNHX2的表達在ABA、NaCl、冷、熱和干旱脅迫時變化不大；而在ABA和NaCl的脅迫下，轉AtNHX4-GUS的植株中，GUS的活性增強，表明AtNHX4可能參與了植物的脅迫反應的調控：轉AtNHX3-GUS的植株中，在兩片子葉時受熱的脅迫后能檢測到GU