水稻AOX1基因家族成員逆境下的表達分析及功能鑒定.pdf

1、高等植物線粒體電子傳遞鏈主要有兩條途徑，一條是對氰化物敏感的細胞色素途徑，另一條是抗氰呼吸途徑（或稱交替途徑），對氰化物不敏感，是由線粒體內(nèi)膜上的末端氧化酶AOX（交替氧化酶）所催化的。電子從細胞色素途徑的泛醌處分支直接將電子傳遞給AOX，由AOX氧化生成水，不生成ATP，能量以熱的形式釋放。AOX屬于雙核鐵羧基蛋白質(zhì)家族，由小的核基因所編碼。AOX的表達受到多種生物和非生物脅迫所誘導(dǎo)。關(guān)于AOX的生物學(xué)功能和抗氰呼吸途徑一直是植物生理

2、學(xué)領(lǐng)域中研究的熱門課題。目前單子葉植物中AOX的研究較少，已有的研究多集中于冷、旱等單一逆境脅迫下AOX整體水平的研究，對各個成員的研究較少，信號調(diào)控途徑也不清楚。
　　 本研究首先利用OsAOX1基因的特異性探針，研究了在逆境（冷、熱、鹽、旱）和氧化藥物處理下OsAOX1基因家族的表達模式;并從水稻中克隆了OsAOX1a口、OsAOX1b基因?qū)ζ湫蛄羞M行了測序比對和進化分析。同時還構(gòu)建了OsAOX1a口、OsAOX1b基因的植

3、物超表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻（日本晴），獲得轉(zhuǎn)基因植株，對T2代純合轉(zhuǎn)基因植株進行了抗逆生物學(xué)的功能分析，和逆境（冷和旱）條件下轉(zhuǎn)基因超表達植株的生理指標（電導(dǎo)率和丙二醛含量）測定，顯示結(jié)果如下:
　　 (1)根據(jù)生物信息學(xué)資料，設(shè)計OsAOX1a、OsAOX1b、OsAOX1c的特異性引物，對其在逆境下的表達模式進行了分析。結(jié)果表明:OsAOX1a和OsAOX1b受各種逆境脅迫的誘導(dǎo)，OsAOX1c基本不受誘導(dǎo)。在鹽、

4、旱、冷逆境脅迫下OsAOX1a、OsAOXb誘導(dǎo)倍數(shù)隨時間的延長而逐漸增長，OsAOX1a口在鹽、旱、冷逆境脅迫24h時出現(xiàn)最高誘導(dǎo)倍數(shù)，依次為30.7倍、12.3倍、17.5倍;OsAOX1b最高誘導(dǎo)倍數(shù)依次為36.6倍、15.2倍、7.1倍。OsAOX1a口在熱脅迫下表達水平變化趨勢與鹽、旱、冷逆境下變化趨勢相同，但24h最高誘導(dǎo)倍數(shù)為對照的8.9倍。OsAOX1b受熱脅迫表達水平變化并不像鹽、旱、冷誘導(dǎo)倍數(shù)隨時間延長呈現(xiàn)明顯增長，

5、其受高溫誘導(dǎo)最高誘導(dǎo)倍數(shù)為10.6倍出現(xiàn)在受脅迫1h。此外OsAOX1a口、OsAOX1b在氧化藥物H2O2和MV（甲基紫精）處理下的表達量變化分析顯示:二者均受這兩種氧化藥物的誘導(dǎo)。OsAOX1a口和OsAOX1b受H2O2誘導(dǎo)表達變化均在5倍以下;而在MV脅迫下表達量變化較H2O2明顯增強，OsAOX1a受誘導(dǎo)38.8倍，OsAOX1b受誘導(dǎo)117.2倍。
　　 (2)利用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)從水稻中克隆得到了兩個基

6、因OsAOX1a、OsAOX1b。OsAOX1a(LOC-Os04g51150)基因序列全長為999bp，含有四個外顯子和三個內(nèi)含子，該基因預(yù)測編碼333個氨基酸，分子量為37136.5D，等電點為8.2369。OsAOX1b(LOC-Os04g51160)基因序列全長為1008bp，有三個外顯子和兩個內(nèi)含子，該基因預(yù)測編碼336個氨基酸，分子量為37250.5D，等電點為8.0404。
　　 (3)構(gòu)建了相應(yīng)的超表達載體(記為

7、OE-OsAOX1a和OE-OsAOX1b)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)進行水稻遺傳轉(zhuǎn)化，對得到的轉(zhuǎn)基因植株T0代幼苗進行PCR鑒定后移栽種植。對T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子經(jīng)潮霉素萌發(fā)鑒定，挑選分離比符合3∶1的株系。對這些株系的T1代幼苗進行PCR鑒定和westernblot分析，表明在T1代轉(zhuǎn)基因水稻中OsAOX1a、OsAOX1b已成功表達。
　　 (4)將T1代中選出的株系擴繁至T2代，經(jīng)PCR鑒定、表達量鑒定和westernblo

8、t分析驗證基因穩(wěn)定表達后，對T2代轉(zhuǎn)基因植株進行了功能分析。低溫脅迫下，超表達轉(zhuǎn)基因植株較對照植株明顯提高了抗冷性;且OsAOX1a和OsAOX1b超表達植株和對照植株相比，無論是地上部分還是地下部分都表現(xiàn)出更強的耐冷性。冷脅迫下OE-OsAOX1a轉(zhuǎn)基因株系line1的根長和莖長分別是同時期對照植株根長和莖長的3.8倍和3.2倍;OE-OsAOX1a轉(zhuǎn)基因株系line2的根長和莖長分別是對照植株根長和莖長的2.8倍和2.5倍;OE-O

9、sAOX1b轉(zhuǎn)基因株系line3的根長和莖長分別是對照植株根長和莖長的5.2倍和5.8倍;OE-OsAOX1b轉(zhuǎn)基因株系line4的根長和莖長分別是對照植株根長和莖長的4.8倍和6.0倍。
　　 (5)在功能驗證的基礎(chǔ)上，對T2代純合植株進行了逆境下電導(dǎo)率和丙二醛含量(MDA)生理指標的測定。結(jié)果表明:冷脅迫下OE-OsAOX1a的轉(zhuǎn)基因植株line1和line2的電導(dǎo)率比同時期對照植株依次降低1.1倍和1.22倍，OE-OsA

10、OX1b的轉(zhuǎn)基因植株line3和line4則依次降低了1.45倍和1.57倍。冷脅迫下兩種超表達植株的MDA含量分析指出:OE-OsAOX1a的轉(zhuǎn)基因line1和line2株系MDA含量比對照植株依次降低了1.1倍和1.32倍;OE-OsAOX1b的轉(zhuǎn)基因line3和line4株系MDA含量比對照植株降低了1.30倍和1.35倍。結(jié)果說明了超表達OsAOX1a或OsAOX1b可以減輕膜的傷害程度。
　　 上述結(jié)果說明:這種機制極