孕期咖啡因暴露誘導(dǎo)子代血管平滑肌功能改變的離子通道機(jī)制研究.pdf

1、大量研究表明不良刺激可增加子代罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)?？Х取⒉?、可樂(lè)等含相當(dāng)量咖啡因，咖啡因可通過(guò)直接影響肌細(xì)胞的收縮性而影響心血管功能。隨著含咖啡因食品的普及，孕期咖啡因暴露對(duì)子代心血管的影響雖日益受到關(guān)注，但相關(guān)研究很少，多為在體水平，針對(duì)胎兒或者新生兒的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，極少有研究涉及子代出生后至成年過(guò)程中的心血管發(fā)育的“程序化調(diào)控”，尤其涉及離子通道機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
　　本課題重點(diǎn)運(yùn)用膜片鉗技術(shù)，激光共聚焦，同步動(dòng)

2、態(tài)監(jiān)測(cè)微動(dòng)脈直徑和血管細(xì)胞內(nèi)鈣離子實(shí)時(shí)變化技術(shù)，結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)探討孕期咖啡因暴露可能誘導(dǎo)子代血管平滑肌細(xì)胞中與膜電位調(diào)節(jié)相關(guān)的鈣信號(hào)及其與下游大電導(dǎo)鈣依賴(lài)性鉀通道（Large conductance Ca2+ dependent-K+-channels, BKCa）偶聯(lián)的異常，致膜電位失衡，血管張力增加。
　　第一部分孕期咖啡因暴露對(duì)胎鼠發(fā)育及成年子代體重的影響
　　目的：研究孕期咖啡因暴露對(duì)胎鼠發(fā)育及成年子代大鼠體重的

3、影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)組孕鼠從妊娠第3.5天到第19.5天給予咖啡因皮下注射（20mg/kg, twice a day）。對(duì)照組給予生理鹽水注射。在孕第20.5天剖腹產(chǎn)取胎鼠，稱(chēng)量胎鼠體重、體長(zhǎng)和尾長(zhǎng)。自然分娩后，在哺乳期內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組給予正常飲食，幼鼠母乳喂養(yǎng)。斷奶后，子代大鼠給予正常飲食直至5月齡用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)抽取部分子代成年大鼠，測(cè)體重。
　　結(jié)果：
　　1）孕期咖啡因暴露組胎鼠的體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、體重明顯低于對(duì)照組

4、胎鼠；孕期咖啡因暴露導(dǎo)致胎鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)受限（IUGR）發(fā)生率顯著增加；
　　2）子代成年大鼠體重各組間無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：孕期咖啡因暴露導(dǎo)致胎鼠宮內(nèi)生長(zhǎng)受限，經(jīng)過(guò)追趕性生長(zhǎng)，子代成年大鼠（雄性）的體重差異消失。
　　第二部分孕期咖啡因暴露對(duì)子代血壓，腸系膜動(dòng)脈收縮功能及血管平滑肌細(xì)胞膜電位的影響
　　目的：研究孕期母體咖啡因暴露對(duì)子代大鼠血壓、心率等心血管功能指標(biāo)和離體腸系膜動(dòng)脈張力的影響，并在細(xì)胞水平初步指出

5、子代血管張力的變化與平滑肌細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)異常相關(guān)。
　　方法：子代大鼠行股動(dòng)、靜脈插管術(shù)，以PowerLab生理記錄儀在體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物清醒無(wú)應(yīng)激條件下的血壓、心率等指標(biāo)。部分子代分離腸系膜動(dòng)脈后，制備血管環(huán)，以PowerLab生理記錄儀檢測(cè)血管張力情況。分離單個(gè)腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，以膜片鉗技術(shù)記錄細(xì)胞膜電位。
　　結(jié)果：
　　1）孕期咖啡因暴露誘導(dǎo)成年子代升壓反應(yīng)異常，基礎(chǔ)狀態(tài)下兩組子代收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和心

6、率等心血管指標(biāo)無(wú)明顯差異；在血管收縮物質(zhì)如去氧腎上腺素（PE）刺激下，孕期咖啡因組子代的升壓反應(yīng)較正常對(duì)照組子代明顯；
　　2）孕期咖啡因暴露誘導(dǎo)成年子代阻力血管張力增大，對(duì)PE的收縮反應(yīng)較對(duì)照組明顯。在PE作用下咖啡因組子代腸系膜動(dòng)脈的最大收縮及pD2都較對(duì)照組明顯增大。兩組內(nèi)皮功能未見(jiàn)明顯損傷；
　　3）孕期咖啡因組子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)出現(xiàn)異常。雖然靜息狀態(tài)下，兩組膜電位未見(jiàn)明顯差異，但PE作用下，孕期咖啡

7、因組子代細(xì)胞膜電位去極化異常，膜電位較對(duì)照組明顯升高。
　　結(jié)論：血管收縮劑PE引發(fā)的異常升壓反應(yīng)可能與阻力血管張力增大，平滑肌細(xì)胞收縮增強(qiáng)有關(guān)
　　第三部分孕期咖啡因暴露對(duì)子代平滑肌細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞鈣信號(hào)的影響
　　目標(biāo)：研究孕期母體咖啡因暴露對(duì)子代平滑肌細(xì)胞膜電位調(diào)節(jié)相關(guān)鈣信號(hào)的影響。
　　方法：電壓門(mén)控性鈣通道電流以Ba2+作載體，并在電極內(nèi)液中加Cs+及細(xì)胞外液中加TEA-Cl阻斷鉀電流，采用傳統(tǒng)

8、全細(xì)胞電壓鉗模式來(lái)記錄全細(xì)胞鈣電流。以熒光鈣成像實(shí)時(shí)同步檢測(cè)血管細(xì)胞內(nèi)鈣與血管直徑變化，觀察ryanodine阻斷對(duì)胞內(nèi)鈣釋放和血管收縮反應(yīng)的影響。用Western blot法對(duì)比兩組LTCCsα1C亞基的表達(dá)，用RT-PCR和 ELISA技術(shù)檢測(cè)兩組 RyRs亞型的表達(dá)，熒光顯微鏡下觀察 caffeine對(duì)ryanodine敏感的鈣庫(kù)的耗竭作用。
　　結(jié)果：L型鈣通道電流密度在孕期咖啡因組顯著下降；孕期咖啡因組子代腸系膜動(dòng)脈L型

9、鈣通道α1C亞基的蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組；孕期咖啡因暴露可誘導(dǎo)胞ryanodine敏感的內(nèi)鈣釋放功能降低。
　　結(jié)論：L型鈣通道功能下降致胞外鈣內(nèi)流效果減弱，但是孕期咖啡因暴露可誘導(dǎo)胞ryanodine敏感的內(nèi)鈣釋放功能降低，此作用可能進(jìn)一步誘導(dǎo)了胞內(nèi)鈣釋放偶聯(lián)的下游BKCa通道的調(diào)節(jié)減弱，致使膜電位去極化增強(qiáng)
　　第四部分孕期咖啡因暴露對(duì)子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流的影響
　　目的：研究孕期咖啡因暴露

10、對(duì)子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道電流的影響
　　方法：運(yùn)用膜片鉗單通道技術(shù)檢測(cè)子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa通道生物物理特性的變化。運(yùn)用穿孔膜片鉗技術(shù)檢測(cè)各組BKCa通道瞬時(shí)外向鉀電流的變化。運(yùn)用傳統(tǒng)全細(xì)胞模式記錄BKCa通道全細(xì)胞電流。運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)兩組BKCa通道α亞基和β1亞基蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1）孕期咖啡因暴露誘導(dǎo)子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌全細(xì)胞鉀電流密度降低，BKCa通道

11、電流密度降低；
　　2）孕期咖啡因暴露誘導(dǎo)子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞瞬時(shí)外向鉀電流（STOCs）活性下降；
　　3）孕期咖啡因刺激誘導(dǎo)BKCa通道生物物理特性異常：BKCa通道電壓敏感性，Ca2+敏感性下降；動(dòng)力學(xué)特征改變，表現(xiàn)為開(kāi)放時(shí)間縮短，關(guān)閉時(shí)間延長(zhǎng)；
　　5）孕期咖啡因暴露對(duì)子代腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α亞基蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，β1亞基蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：孕期母體咖啡因暴露通過(guò)改變子代平滑肌細(xì)胞BKCa