血管平滑肌大電導鈣激活鉀通道(BKCa)人工重建的研究.pdf

1、 目的：血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)上的大電導鈣激活鉀通道(large conductance calcium-activated potassium channels, BKCa)的活動直接參與了血管平滑肌的舒張調(diào)節(jié),在血壓維持中起重要作用。在天然細胞上有關BKCa通道的動力學特性、通道調(diào)控點、藥物作用靶點等的研究存在一定的局限性,但是將BKCa通道蛋白重建到平面雙分子層脂質(zhì)

2、膜(Panar lipid bilayers ,PLBMs)上則可更好地進行以上研究。本實驗旨在摸索建立穩(wěn)定的平面雙分子層脂質(zhì)膜制備方法,并摸索將克隆的血管平滑肌細胞BKCa通道蛋白融合其上進行單通道電流研究。本項目通過聯(lián)合單通道膜片鉗技術,考馬斯亮藍染色和免疫印跡法 (Western blot)等方法證實所建立的人工BKCa通道重建技術的可行性,為下一步研究BKCa通道調(diào)控點和藥物作用靶點提供技術支持。方法：(1)PLBMs 實驗：將

3、不同濃度的卵磷脂或不同比例的卵磷脂與膽固醇混合液作為成膜液,采用涂抹法制備PLBMs；實驗中控制膜脂質(zhì)的成分和周圍電解質(zhì)環(huán)境,尋找最佳成膜條件；將含有兩性霉素B的脂質(zhì)體或α-toxin加入膜的一側溶液內(nèi), 使其與PLBMs融合并形成孔道,觀察孔道形成過程中脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性；(2)重建到PLBMs上的BKCa的單通道實驗：將BKCa通道蛋白重建到PLBMs上進行單通道電流記錄,通道信號經(jīng) BC-535 放大器放大,1KHz 濾波, Clam

4、pex 10.2軟件采集,并經(jīng)Clampfit 10.1軟件分析。(3)轉染有BKCaα亞基的人胚腎(human embryonic kidney ,HEK293)細胞上的BKCa單通道膜片鉗實驗：該實驗作為重建到脂質(zhì)膜上的BKCa的對照實驗。選取立體感強、狀態(tài)好并轉染有BKCaα亞基的HEK293細胞進行實驗,在對稱性高鉀溶液中,采用內(nèi)面向外模式(inside-out patch)記錄BKCa的單通道電流。單通道電流信號經(jīng)CEZ-22

5、00膜片鉗放大器放大,1KHz濾波后輸入計算機,經(jīng)pClamp 10.0軟件采集記錄,并用Clampfit 10.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。(4)考馬斯亮藍染色和Western blot檢測制備的BKCa脂質(zhì)體的純度：收集低滲裂解的轉染有BKCaα亞基的HEK293細胞碎片,經(jīng)20%-38%蔗糖/MOPS密度梯度離心得BKCa脂蛋白體,將BKCa脂蛋白體變性處理后加樣,選擇合適的電壓進行SDS-PAGE電泳和轉印。用BKCaα兔抗人多克隆抗體

6、(1：500)孵育,洗膜后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1：10,000)孵育。GEL-Doc凝膠成像系統(tǒng)采集圖像,Quantity One 軟件分析結果。結果：(1)涂抹法制備PLBMs實驗：采用不同濃度卵磷脂(phosphatidylcholine, PC)制備的 PLBMs 可穩(wěn)定 3.5h ,而用不同比例的卵磷脂( PC )和膽固醇(Cholesteryl,CH)制備的PLBMs可穩(wěn)定2.5h。兩性霉素B及α- toxin形

7、成孔道過程中,脂質(zhì)膜很穩(wěn)定。(2)重建到平面雙分子層脂質(zhì)膜上的BKCa的單通道基本特性：①重建的 BKCa通道電導值大,為 206.8 ±16.86pS (n=4)。②通道具有明顯的電壓依賴性,在-60mV~+60mV的測試電壓下,隨著細胞膜電位去極化程度的增加,BKCa 通道的電流幅度(Amplitude, Amp)及通道的開放概率(Open probability, NPo)顯著增加,通道的平均開放時間(Open time, To)

8、延長,平均關閉時間(Close time, Tc)縮短。③通道具有明顯的 Ca2+敏感性,cis/trans 側浴液中 Ca2+濃度分別分別由 0mM增加到1μM和100μM時,BKCa通道的開放概率(NPo)明顯增加,呈Ca2+激活特性。④BKCa 通道具有 K+選擇性, Cis/Trans 側 K+濃度為140/140mM 時重建的 BKCa通道反轉電位在 0mV 左右(n=4),K+濃度為40/140mM時重建的BKCa通道反轉電

9、位在-30mV左右(n=2),而根據(jù)Nernst方程計算,K+濃度為140/140mM時,K+平衡電位 (K+equilibrium potential, Ek)為0mV,K+濃度為40/140mM時Ek為-32.6mV。(3)在 inside-out 模式下,HEK293細胞上BKCa的單通道的基本特性：①HEK293細胞上的BKCa通道電導值大,為212.7 ±7.71pS(n=8)。②通道具有明顯的電壓依賴性,在0mV~+60mV

10、的測試電壓下,隨著細胞膜電位去極化程度的增加,BKCa通道的電流幅度(Amp)及通道的開放概率(NPo)顯著增加,通道的平均開放時間(To)延長,平均關閉時間( Tc)縮短。③通道具有明顯的Ca2+敏感性,BKCa通道的開放概率(NPo)隨浴液中[Ca2+]free濃度增加明顯增加,呈Ca2+激活特性。(4)考馬斯亮藍染色和Western blot檢測結果：制備的脂蛋白體(proliposome)含BKCaα亞基,分子量大小為100kD