孕期脂多糖暴露對子代大鼠尿鈉排泄及血管功能的影響及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 孕期脂多糖暴露對子代大鼠腎臟多巴胺D1受體介導的尿鈉排泄的影響及機制研究
　　目的：
　　高血壓是心血管病重要危險因素，其發(fā)病機制復雜。既往認為，基因與環(huán)境之間均在其中發(fā)揮了重要的作用。近年來，大量研究表明，孕期不良因素也是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，并逐漸形成了“人類健康與疾病的發(fā)育起源”學說。該學說創(chuàng)始人David Barker及其同事認為，如果胚胎在發(fā)育的關鍵階段遭

2、遇不良因素干擾將會對子代機體結構及功能產(chǎn)生長遠影響。
　　母體感染與炎癥是孕期常見的并發(fā)癥之一。大量流行病學調查顯示，孕期感染往往與一些出生后不良事件相關。宮內感染已被認為是胎兒不良因素的重要來源，LPS是格蘭陰性菌胞壁的重要成分，并且存在于人體消化道。通過腹腔注射LPS可以較好地模擬孕期感染模型。母體LPS暴露后可以導致機體、胎盤、羊水、胎兒等產(chǎn)生炎癥因子，IL-1，IL-6和TNF-α等，并影響胚胎發(fā)育。既往研究顯示，孕期LP

3、S暴露可引起子代血壓升高。眾所周知，血壓升高不僅僅是促高血壓因素增強的結果，抗高血壓因素功能降低也在其中發(fā)揮重要的作用，如:腎臟多巴胺能系統(tǒng)即是眾多的抗血壓作用因素之一。
　　腎臟可以產(chǎn)生多巴胺，并已被認為是高血壓發(fā)生發(fā)展及血壓調控的重要因素。根據(jù)其結構和功能，多巴胺受體可以分成D1-(D1R，D5R)和D2-(D2R，D3R和D4R)兩大類共5種亞型。在機體鈉鹽負荷增加時，腎臟多巴胺可以通過D1類受體發(fā)揮顯著的促尿鈉排泄作用，并

4、保持血壓穩(wěn)定。在高血壓患者、鹽敏感性高血壓及遺傳性高血壓動物模型常伴有多巴胺功能異常。之前的研究表明，腎臟D1R功能紊亂主要由其磷酸化水平升高導致，而后者則由腎臟GRK2、GRK4表達及活性升高引起。研究表明，氧化應激可以導致腎臟GRK2、GRK4表達及活性顯著升高。通過抗氧化劑TEMPOL干預，可以降低體內氧化應激水平，恢復D1R磷酸化和表達水平，以及血壓。
　　因此，將探討孕期LPS暴露對子代大鼠腎臟多巴胺D1R介導的尿鈉排泄

5、功能的影響，以及通過抗氧化干預是否可以恢復D1R功能。
　　方法：
　　成年受孕SD大鼠在孕期第8，10，12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79 mg/kg)，對照組注射等容積生理鹽水(0.5 ml)。子代大鼠出生后使用尾動脈無創(chuàng)血壓測量法監(jiān)測血壓，并在第12周時分別給予抗氧化劑（TEMPOL，1.0 mmol/L飲水）干預3周。
　　分別檢測以下指標:
　　1.2.1子代大鼠出生后5周、3月、6月、9月、12月時

6、鼠尾血壓及兩組間血壓差值。
　　1.2.2分別用HE染色劑Masson三色法檢測腎臟形態(tài)學改變。
　　1.2.3檢測兩組大鼠基礎狀態(tài)下24小時尿量、總尿鈉排泄及血壓。
　　1.2.4子代大鼠氧化應激檢測，尿液MDA，血漿SOD，腎臟SOD及GSH水平。
　　1.2.5子代大鼠腎臟多巴胺D1R介導的尿流速及尿鈉排泄率。
　　1.2.6子代大鼠腎臟GRK2，GRK4，D1R蛋白表達水平。
　　1.2.7子

7、代大鼠腎臟D1R磷酸化水平。
　　結果：
　　1.3.1孕期LPS暴露引起子代大鼠出生后血壓連續(xù)性升高。
　　1.3.2孕期LPS暴露引起子代大鼠基礎狀態(tài)下24小時總尿量及總尿鈉排泄降低。
　　1.3.3孕期LPS暴露導致子代大鼠腎臟D1R介導的尿鈉排泄功能受損，D1R蛋白表達降低，磷酸化升高。
　　1.3.4孕期LPS暴露子代大鼠腎臟D1R重要調節(jié)激酶GRK2、GRK4表達升高。
　　1.3.5 L

8、PS組子代大鼠腎臟氧化應激指標升高，如尿液丙二醛水平(MDA);抗氧化指標降低，如血漿及腎臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量。
　　1.3.6通過抗氧化干預可以顯著改善氧化與抗氧化狀態(tài)，恢復GRK4、D1R蛋白表達，降低D1R磷酸化水平，并進一步改善D1R介導的尿鈉排泄功能及血壓。
　　結論：
　　孕期脂多糖暴露可以通過ROS途徑導致子代大鼠腎臟GRK2、GRK4表達升高，進一步導致D1R過度磷酸化及其

9、介導的尿鈉排泄功能障礙，最終導致血壓升高。
　　第二部分 孕期脂多糖暴露對子代大鼠腸系膜動脈血管功能的影響及機制研究
　　目的：
　　之前的研究發(fā)現(xiàn)，孕期LPS暴露導致子代大鼠腎臟多巴胺受體D1R介導的尿鈉排泄功能受損。另外，有研究報道，孕期LPS暴露引起子代大鼠腎臟血管緊張素受體1型及2型比例(AT1R/AT2R)失衡，并通過激活核轉錄因子-κB（NF-κB）以及降低胸主動脈縫隙連接蛋白37表達引起子代大鼠血管功能障

10、礙及血壓升高，但是對血管功能并無研究。由于胸主動脈是容量血管，在血壓形成中發(fā)揮的作用較為有限，研究阻力血管功能，如腸系膜動脈，對研究子代大鼠血壓形成具有重要意義。
　　大量研究表明，血管內皮功能在血壓調節(jié)中具有重要作用，內皮依賴性舒張功能降低是高血壓形成的重要原因。血管內皮細胞可以釋放多種血管活性物質，如:內皮源性舒張因子NO。NO可通過彌散進入平滑肌細胞，刺激鳥苷酸環(huán)化酶活性，導致cGMP含量增加，從而舒張血管。因此，腸系膜動脈

11、NO-cGMP信號通路受損在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　因此，研究主要探索孕期LPS暴露是否對子代大鼠腸系膜動脈NO-cGMP通路造成影響及其可能的機制，并進一步探索如何恢復受損的血管功能及降低血壓，為闡明胎兒程控性高血壓的發(fā)生機理提供指導。
　　方法：
　　成年受孕SD大鼠在孕期第8，10，12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79 mg/kg)，對照組注射等容積生理鹽水(0.5 ml)，子代大鼠出生后使用尾動脈無

12、創(chuàng)血壓監(jiān)測法每兩周檢測一次血壓，并在第15周時分別檢測基礎狀態(tài)下及給予抗氧化劑(TEMPOL，1mmol/L飲水)干預3周后子代大鼠血管功能。
　　分別檢測以下指標:
　　2.2.1腸系膜動脈組織形態(tài)學改變。
　　1.2.2腸系膜動脈基礎狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME(10-4 mol/L)或烏苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ(10-5 mol/L)后對苯腎上腺素(phenylephrine，PE)介導的收縮

13、反應性。
　　2.2.3腸系膜動脈去內皮前、后對PE介導的血管收縮反應性。
　　2.2.4腸系膜動脈基礎狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME(10-4 mol/L)或鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ(10-5 mol/L)后對乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)介導的舒張反應性。
　　2.2.5腸系膜動脈去內皮后對硝普鈉(SNP)介導的內皮非依賴性血管舒張。
　　2.2.6腸系膜動脈eNOS及GC

14、蛋白表達，完整血管內皮下Ach刺激后NO生成反應性以及去內皮后SNP刺激下cGMP生成反應性。
　　2.2.7腸系膜阻力動脈超氧陰離子(DHE)水平及基礎狀態(tài)下AngⅡ含量。
　　2.2.8通過Western Blot檢測腸系膜動脈eNOS、sGC、AT1R、NOX2、NOX4、nitrotyrosine、 SOD1和SOD2蛋白表達水平。
　　結果：
　　2.3.1孕期脂多糖暴露組子代大鼠血壓自出生后第5周起顯

15、著高于對照組，并持續(xù)到觀察期第19周。
　　2.3.2孕期LPS暴露的子代大鼠出生后第15周時，其完整內皮下由Ach介導的內皮依賴性舒張功能降低，PE介導的血管收縮功能增強。
　　2.3.3孕期LPS暴露的子代大鼠腸系膜血管內皮去除后，由PE介導的腸系膜動脈收縮較對照組顯著減弱。
　　2.3.4預先孵育一氧化氮合酶抑制劑L-NAME阻斷內皮一氧化氮合酶(eNOS)活性劑或鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ阻斷平滑肌細胞c

16、GMP合成，顯著減弱對照組子代大鼠Ach介導的舒張，增強PE介導的收縮，但在LPS子代大鼠無顯著變化。
　　2.3.5孕期LPS暴露的子代大鼠由SNP介導的內皮非依賴性舒張功能明顯降低。
　　2.3.6孕期LPS暴露的子代大鼠血管eNOS、GC蛋白表達，NO、cGMP含量顯著降低，氧化應激水平增加(DHE、AT1R、NOX2、NOX4、nitrotyrosine)，抗氧化能力降低(SOD1、SOD2)。
　　2.3.7

17、通過給予抗氧化劑TEMPOL干預3周，可以顯著恢復LPS子代大鼠體內氧化失衡狀態(tài)，以及eNOS、GC蛋白表達和NO、cGMP含量;同時可以顯著恢復血管功能及血壓。
　　結論：
　　孕期脂多糖暴露可以導致子代大鼠出生后血壓升高，以及腸系膜血管NO-cGMP通路受損，導致內皮依賴性及非依賴性舒張功能障礙。另外，LPS子代大鼠體內氧化應激升高在血管功能障礙中發(fā)揮了重要作用。
　　全文結論：
　　孕期脂多糖暴露可以通過氧