鼻腔給予己酮可可堿對(duì)氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇發(fā)作的預(yù)防作用.pdf

1、癲癇(Epilepsy，EP)是神經(jīng)科常見的疾病之一，臨床表現(xiàn)為突然出現(xiàn)、反復(fù)發(fā)生的驚厥行為。研究發(fā)現(xiàn)短暫或持續(xù)性癲癇發(fā)作，均會(huì)引起腦部神經(jīng)元損傷和喪失，患者常伴有運(yùn)動(dòng)缺陷和學(xué)習(xí)記憶障礙等。
　　 近年的研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)作(epilepticseizure，ES)與多巴胺(dopamine，DA)密切相關(guān)。在匹羅卡品誘發(fā)的幼鼠和成年大鼠癲癇模型中，高效液相色譜分析顯示，紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物二羥基苯乙酸(DOPAC)降低。癲癇病

2、人腦脊液中DA及其代謝產(chǎn)物高香草酸(HVA)含量降低，抗癲癇治療后含量有所升高。目前癲癇發(fā)生的機(jī)制尚不清楚，有研究證實(shí)活性氧參與了癲癇持續(xù)狀態(tài)的病理生理學(xué)改變。癲癇時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)的過度活動(dòng)與自由基的過量產(chǎn)生有關(guān)，活性氧可迅速改變神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能。抑制過度活動(dòng)的神經(jīng)化學(xué)通路可降低有關(guān)神經(jīng)元的興奮性、減少神經(jīng)元的損傷，改變癲癇行為狀態(tài)，這可能是癲癇治療的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。
　　 己酮可可堿（Pentoxifylline，PTX）是一

3、種非特異性磷酸二酯酶抑制劑，具有強(qiáng)抗氧化作用。最初PTX用來治療呼吸系統(tǒng)和外周循環(huán)障礙疾病。近年的研究發(fā)現(xiàn)PTX具有神經(jīng)保護(hù)作用，可用于治療有關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病，如腦局部缺血、神經(jīng)外傷和癡呆;此外PTX還可改善海馬損傷大鼠的學(xué)習(xí)和記憶。研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰-匹羅卡品(lithium-pilocarpine，Li-Pc)誘發(fā)的癲癇大鼠預(yù)先腹腔注射PTX，可以降低癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度和次數(shù)，具有一定的抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 癲癇發(fā)作

4、在治療上要求立刻終止癲癇發(fā)作及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。靜脈點(diǎn)滴、腹腔注射等并不能在癲癇發(fā)作時(shí)即刻實(shí)施，可能會(huì)延誤治療時(shí)機(jī)，情況危急時(shí)可威脅到人的生命。近年有研究報(bào)道鼻腔給予PTX與靜脈注射達(dá)到同樣的藥物治療濃度。鼻腔給藥既方便又快捷，是近年某些藥物制劑首選的給藥方法，但目前尚不確定鼻腔給予PTX是否具有抗癲癇作用。
　　 因此，本研究以雄性Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過分析大鼠有關(guān)的行為變化，探討腹腔和鼻腔給予PTX對(duì)Li-Pc處理

5、大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，通過Thionin染色和Timm染色分別觀察海馬神經(jīng)元損傷及苔蘚纖維出芽的變化，并通過免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡探討與行為密切相關(guān)的中腦多巴胺能神經(jīng)元所發(fā)揮的作用，期望所獲結(jié)果為以鼻腔給予PTX防治癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的:觀察腹腔和鼻腔給予PTX對(duì)Li-Pc誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作大鼠腦內(nèi)酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的改變，期望所獲結(jié)果為以鼻腔給予PTX防治癲癇等中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾

6、病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:將雄性Wistar大鼠(300g左右)隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(Con，n=15)、氯化鋰對(duì)照組(Li，n=15)、癲癇組(ES，n=21)、己酮可可堿腹腔給藥組(ES+PTX.ip，n=21)、己酮可可堿鼻腔給藥組(ES+PTX.in，n=21)。Con組和Li組分別腹腔注射生理鹽水和氯化鋰(127mg/kg);另外三組用Li-Pc誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，先腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)，20h后腹腔注

7、射匹羅卡品(15mg/kg);PTX腹腔給藥組和鼻腔給藥組在匹羅卡品注射前30min分鐘分別通過腹腔和鼻腔給予PTX(60mg/kg)。
　　 觀察給藥后大鼠癲癇發(fā)作的情況，癲癇發(fā)作的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Racine評(píng)分法。隨后通過Thionin染色和Timm染色觀察大鼠海馬神經(jīng)元損傷及苔蘚纖維發(fā)芽的情況，通過免疫組織化學(xué)和免疫印記來檢測腦內(nèi)酪氨酸羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.一般觀察

8、　　 Con組和Li組均無異常反應(yīng)。在給予匹羅卡品后，ES組95.24％的大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作的平均潛伏期為17.18±5.20min;ES+PTX.ip組66.67％的大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作的平均潛伏期為30.74±9.65min;ES+PTX.in組66.67％的大鼠出現(xiàn)癲癇發(fā)作，癲癇發(fā)作的平均潛伏期為27.37±6.92min。結(jié)果顯示腹腔和鼻腔給予PTX顯著增加了大鼠癲癇發(fā)作的潛伏期，分別增加了78％(P＜0.01)

9、和59％(P＜0.01)。
　　 2.Thionin和Timm染色
　　 1)Thionin染色:尼氏體常被稱為嗜染質(zhì)，主要成分是核糖核酸(RNA)和蛋白質(zhì)，可被硫堇染成紫藍(lán)色。光鏡下觀察海馬CA1、CA3和齒狀回門區(qū)神經(jīng)元改變。Con組和Li組無差異，可見神經(jīng)元形態(tài)完整、邊界清晰、尼氏小體豐富。與Con組相比，ES組大鼠在海馬CA1、CA3和齒狀回門區(qū)可見部分神經(jīng)元脫失，細(xì)胞形態(tài)不完整，細(xì)胞腫脹破裂、輪廓模糊，排列紊亂

10、，胞漿內(nèi)尼氏體減少，錐體層和齒狀回顆粒細(xì)胞層神經(jīng)元計(jì)數(shù)減少（P＜0.01）。與ES組相比，ES+PTX.ip組和ES+PTX.in組大鼠在上述腦區(qū)神經(jīng)元缺失程度明顯減輕(P＜0.01)。
　　 2)Timm染色:苔蘚纖維終末富含有Zn2+，能被Timm硫化銀染色方法特異性染色，顯示為棕黃或黑色顆粒。與Con組相比，ES組大鼠海馬CA3始層可見Timm染色顆粒明顯增多(P＜0.01)，齒狀回分子層無顯著差異。與ES組相比，ES+P

11、TX.ip組和ES+PTX.in組大鼠海馬苔蘚纖維出芽減輕，CA3區(qū)Timm染色顆粒密度降低(P＜0.01)，接近Con水平。
　　 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　 1)PTX對(duì)癲癇發(fā)作大鼠TH表達(dá)的影響
　　 對(duì)免疫組織化學(xué)測量結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，ES組大鼠SN、CPu、VTA的TH表達(dá)比Con組分別降低了19％(P＜0.01)、12％(P＜0.01)、11％(P＜0.05)。Li組、ES+PTX.ip組、ES+P

12、TX.in組與Con組相比無顯著差異。預(yù)先給予PTX，癲癇發(fā)作的大鼠TH表達(dá)免疫反應(yīng)強(qiáng)度增強(qiáng)。與ES組相比，ES+PTX.ip組大鼠SN、CPu、VTA的TH表達(dá)分別升高了12％(P＜0.01)、15％(P＜0.01)和11％(P＜0.05);ES+PTX.in組大鼠SN、CPu、VTA的TH表達(dá)分別升高了25％(P＜0.01)、14％(P＜0.01)和12％(P＜0.05)。
　　 2)PTX對(duì)癲癇發(fā)作大鼠DAT表達(dá)的影響

13、r>　　 統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)ES組大鼠SN、CPu、VTA的DAT表達(dá)比Con組分別降低了21％(P＜0.01)、6％(P＜0.05)、26％(P＜0.01)。Li組與Con組相比無顯著差異。與ES組相比，ES+PTX.ip組大鼠SN、CPu、VTA的DAT表達(dá)分別升高了51％(P＜0.01)、16％(P＜0.01)和34％(P＜0.01);ES+PTX.in組大鼠SN、CPu、VTA的DAT表達(dá)分別升高了48％(P＜0.01)、17％(P

14、＜0.01)和28％(P＜0.01)。
　　 4.免疫印跡結(jié)果
　　 1)PTX對(duì)癲癇發(fā)作大鼠TH表達(dá)的影響
　　 免疫印跡顯示TH蛋白條帶位于約60kD處。與Con組相比，ES組大鼠TH的相對(duì)表達(dá)在SN、CPu和VTA分別降低了32％(P＜0.01)、21％(P＜0.01)和24％(P＜0.01)。Li組與Con組相比無顯著差異。與ES組相比，ES+PTX.ip組大鼠在SN、CPu、VTA腦區(qū)TH的相對(duì)表達(dá)分別

15、升高了68％(P＜0.01)、41％(P＜0.01)和51％(P＜0.01)，且SN、VTA的TH表達(dá)高于Con組;ES+PTX.in組大鼠在SN、CPu、VTA腦區(qū)TH的相對(duì)表達(dá)分別升高了58％(P＜0.01)、45％(P＜0.01)和56％(P＜0.01)，且VTA的TH相對(duì)表達(dá)高于Con組。
　　 2)PTX對(duì)癲癇發(fā)作大鼠DAT表達(dá)的影響
　　 免疫印跡顯示DAT蛋白條帶位于約50kD處。與Con組相比，ES組大鼠

16、在SN、CPu和VTA腦區(qū)DAT的相對(duì)表達(dá)分別降低了20％(P＜0.01)、15％(P＜0.01)和15％(P＜0.01)。Li組與Con組相比無顯著差異。與ES組相比，ES+PTX.ip組大鼠在SN、CPu、VTA腦區(qū)DAT的相對(duì)表達(dá)分別升高了42％(P＜0.01)、40％(P＜0.01)和47％(P＜0.01)，且三個(gè)腦區(qū)的DAT相對(duì)表達(dá)均高于Con組;ES+PTX.in組大鼠在SN、CPu、VTA腦區(qū)DAT的相對(duì)表達(dá)分別升高了43

17、％(P＜0.01)、37％(P＜0.01)和43％(P＜0.01)，且三個(gè)腦區(qū)的DAT相對(duì)表達(dá)均高于Con組。
　　 結(jié)論:
　　 1.PTX降低癲癇發(fā)作率、延長癲癇發(fā)作潛伏期;減少癲癇發(fā)作所致海馬神經(jīng)細(xì)胞的缺失及苔蘚纖維發(fā)芽，具有明顯的抗癲癇和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 2.Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠SN、VTA及CPu的TH與DAT表達(dá)降低;PTX預(yù)處理可提高Li-Pc誘發(fā)癲癇大鼠上述腦區(qū)TH和DAT的表達(dá)。