人精液和卵泡液中抑制素B(INh-B)的分離純化與鑒定研究.pdf

1、研究背景:
　　血清抑制素B（INH-B）的檢測在男性不育癥的診治中已逐漸得到廣泛的應(yīng)用。一般認(rèn)為INH-B更能直接反映睪丸的生精功能，并具有無創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)，可作為評價(jià)男性生育力的重要指標(biāo)，諸如預(yù)測非阻塞性無精癥患者行睪丸穿刺能否獲得精子的參考依據(jù)[1][2]。
　　目前國際國內(nèi)應(yīng)用的血清INH-B檢測試劑盒幾乎全是英國DSL公司的產(chǎn)品，且價(jià)格昂貴。DSL公司以Groome NP實(shí)驗(yàn)室的雄厚研究基礎(chǔ)為支撐，將其研究結(jié)果成功轉(zhuǎn)化

2、。查閱文獻(xiàn)凡INH-B研究所用的抗體最初都是該實(shí)驗(yàn)室惠贈。在90's年代開發(fā)出第一代INH-B ELISA檢測試劑盒，在2000年又改進(jìn)推出第二代產(chǎn)品。
　　本研究課題的立項(xiàng)源于市場的需求，因國內(nèi)尚無自主知識產(chǎn)權(quán)的INH-B檢測試劑盒，在某試劑公司的要求下進(jìn)行合作開發(fā)國產(chǎn)化產(chǎn)品。
　　研究目的:
　　制備高特異性、高親和力的單克隆抗體是研發(fā)的核心問題。因此，本研究將集中開展INH-B單抗制備的關(guān)鍵步驟與必要條件的探索。

3、
　　研究表明，男性體內(nèi)INH的重要生理活性形式為INH-B，其組裝過程大部分在生精細(xì)胞內(nèi)完成，然后釋放到循環(huán)系統(tǒng)和精液中[3][4]。女性卵泡液中INH-B的含量為幾十ng/ml～幾百ng/ml，比血液及精液中的含量高約103倍[5][6]。本實(shí)驗(yàn)擬嘗試從人精液和/或人卵泡液中分離純化INH-B，為單抗的篩選提供天然抗原分子。由于對人精液和卵泡液中INH-B的研究相對薄弱，更多的研究資料來源于動物，因此本研究還將對其存在形式和理

4、化性質(zhì)獲得更直接的資料。主要目的有三個(gè):
　　1.探索人精液和卵泡液中INH-B的有效分離純化方法。
　　2.鑒定人精液和卵泡液中INH-B的可能分子存在形式。
　　3.擴(kuò)大人卵泡液中蛋白質(zhì)組成的信息資料。
　　研究路線與方法:
　　1.目的蛋白的富集:采用人精液和卵泡液為研究材料，分別利用乙腈、丙酮、乙醇三種有機(jī)溶劑沉淀法去除樣品中的高豐度蛋白，富集低豐度蛋白INH-B，以及利用飽和硫酸銨分級沉淀方法，比

5、較四種方法對于低豐度目的蛋白INH-B的富集效果。以INH-B ELISA檢測盒的結(jié)果為依據(jù)，跟蹤監(jiān)測并比較四種方法對于低豐度目的蛋白INH-B的富集效果。
　　2.選用DEAE-SephadexA-50陰離子交換柱和羥基磷灰石柱層析、肝素親和柱方法，分離初步富集的樣品以進(jìn)一步純化。同樣方法監(jiān)測并比較三種方法對于樣品的分離純化效果。
　　3.利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)分離法(Rotofor System)對富集樣品和柱分離樣品分別做等

6、電分離比較，以確定柱分離步驟的有效性，同時(shí)鑒定INH-B的等電點(diǎn)。
　　4.利用免疫共沉淀（CO-IP）和Western-blot方法尋找陽性條帶，利用質(zhì)譜分析方法鑒定樣品中INH-B的α、βB兩個(gè)亞基的分子存在形式及成熟卵泡液中部分蛋白質(zhì)的組成。
　　研究結(jié)果:
　　1.由于精液特殊的粘稠性（含大量的精膠蛋白），在對其進(jìn)行有機(jī)溶劑蛋白沉淀和飽和硫酸銨分級沉淀的過程中，去除精膠蛋白的同時(shí)會損失大部分的INH-B。因此，

7、經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，我們放棄了對于精液中INH-B的分離純化和鑒定研究。
　　2.卵泡液樣品經(jīng)丙酮、乙醇、乙腈處理后分別可清除60.9％、46.3％、88.7％的高豐度蛋白，同時(shí)乙腈法能回收61.8％的INH-B。
　　3.通過比較肝素親和柱方法、DEAE-Sephadex A-50陰離子交換柱和羥基磷灰石柱層析三種方法，其中第二種方法最穩(wěn)定，并且能回收樣品中83.2％的INH-B。
　　4.乙腈沉淀處理的卵泡樣品中仍有

8、較多的雜蛋白，因此，經(jīng)DEAE-Sephadex A-50陰離子交換柱處理后的樣品比直接用乙腈沉淀樣品做Rotofor System分離的效果要好。其中，INH-B的回收率為75.3％，卵泡液中INH-B的pI在4.55左右。
　　5.通過質(zhì)譜方法，鑒定出六種成熟卵泡液中存在的蛋白質(zhì)，分別是載脂蛋白D(Apolipoprotein D)、載脂蛋白A(Apolipoprotein A)、載脂蛋白M(ApolipoproteinM)、

9、視黃醇結(jié)合蛋白4(Retinol-binding protein4)、甲狀腺素運(yùn)載蛋白(Transthyretin OS)、SERPINA1蛋白Alpha型抗胰蛋白酶(SERPINA1 Isoform2of Alpha-1-antitrypsin)。
　　結(jié)論:
　　1.卵泡液是INH-B研究的最合適材料。同時(shí)，利用乙腈法處理卵泡原液去除高豐度蛋白是最有效的方法并能保留較多的INH-B。
　　2.使用人卵泡液為實(shí)驗(yàn)材料

10、，利用INH-B本身的生化性質(zhì)，通過乙腈富集、陰離子交換柱分離、等電點(diǎn)分離的“三步分離法”，初步純化獲得人體卵泡液中天然INH-B蛋白分子粗制品，純化回收率達(dá)38.7％，并較準(zhǔn)確鑒定出其在人體中的等電點(diǎn)為4.55。
　　3.利用現(xiàn)有的商品化抗體并沒有鑒定出在精液和卵泡液中INH-B的分子存在形式。但經(jīng)多個(gè)步驟純化已經(jīng)獲得相對含量較高的INH-B粗制品，該產(chǎn)物能否滿足作為抗原供篩選單抗之用，有待進(jìn)一步研究。
　　4.利用質(zhì)譜方