埃博霉素B的分離純化研究.pdf

1、埃博霉素B(Epothilone B)是一種由粘細(xì)菌纖維堆囊菌產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有與紫杉醇相似的抗腫瘤機(jī)制。目前，已有多個(gè)埃博霉素類化合物進(jìn)入臨床研究，并且取得了良好的效果，有望在近年內(nèi)獲準(zhǔn)上市，成為最有潛力的抗腫瘤新藥之一。但埃博霉素的生產(chǎn)成本仍是制約其走向市場(chǎng)的因素之一。本論文研究了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模分離純化埃博霉素B，首先對(duì)發(fā)酵液中收集的樹脂進(jìn)行解吸附研究，接著采用三種方法對(duì)埃博霉素B的分離純化進(jìn)行了研究，為產(chǎn)業(yè)化規(guī)模

2、低成本分離提取埃博霉素B奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文主要研究結(jié)果如下：
　　對(duì)從發(fā)酵液中收集的XAD-16大孔吸附樹脂上的埃博霉素B的最佳解吸附條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明解吸劑甲醇溶液的濃度為80％，解吸pH為6.5，解吸時(shí)間為135 min，解吸次數(shù)為3次，解吸轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)，XAD-16對(duì)埃博霉素 B的解吸量 Q2和解吸率 D分別為達(dá)到最適，即(17.42±0.11) mg/g和(86.32±0.98)%。
　

3、　葡聚糖凝膠LH-20結(jié)合制備型高效液相色譜分離純化埃博霉素B的研究?？疾炝硕喾N因素對(duì)埃博霉素 B分離效果的影響。獲得 LH-20柱層析的工藝條件為：流動(dòng)相是丙酮，流速1.0 mL/min，上樣濃度3.0 mg/mL，柱床高徑比為8:1，其純度可達(dá)(91.6±1.3)%，回收率為(85.9±1.0)%。對(duì)上述制得的埃博霉素B樣品利用制備型高效液相色譜(PHPLC)進(jìn)一步的分離純化，研究 PHPLC的分離條件，流動(dòng)相為乙腈：0.2%冰乙酸

4、水溶液(70:30)，流速為15 mL/min，上樣量為800μL，其純度為(99.1±1.4)%，回收率為(88.3±0.9)%。將EpoB粗提物經(jīng)過二者的層析純化其純度及回收率分別可達(dá)到(99.1±1.4)%，(75.5±0.7)%。
　　常壓反相C18柱層析分離純化埃博霉素B。將C18填料裝入常壓柱中，研究了多個(gè)層析參數(shù)對(duì)回收率及純度的影響。通過實(shí)驗(yàn)得到：流動(dòng)相為55%乙腈水溶液，流速為1.0 mL/min，上樣量為2.0

5、mg/mL以下時(shí)，埃博霉素B的分離效果最好，其純度達(dá)到(95.2±1.2)%，回收率為(88.2±0.7)%。
　　第三種方法是采用分子印跡技術(shù)對(duì)埃博霉素B進(jìn)行分離純化。首先研究了埃博霉素B分子印跡聚合物的合成工藝，采用混合模板法通過沉淀聚合制備埃博霉素B分子印跡聚合物，以吸附量作為主要指標(biāo)對(duì)合成條件進(jìn)行優(yōu)化。最終得到優(yōu)化的合成條件是：埃博霉素 B和埃博霉素 D（1:1）的混合物作為模板分子，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇

6、二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，三者的摩爾比為1:6:20，乙酸乙酯/丙酮(8:2)作為致孔劑，在該條件下合成的聚合物的吸附效果最好，其單位吸附量達(dá)到24.316mg/g。其次，對(duì)該聚合物的吸附性與選擇性進(jìn)行了研究，通過掃描電鏡對(duì)聚合物進(jìn)行表征，并用Scatchard模型來評(píng)價(jià)聚合物的結(jié)合特性，結(jié)果表明印跡聚合物內(nèi)存在對(duì)埃博霉素 B吸附的兩類結(jié)合位點(diǎn)。最后，將埃博霉素 B分子印跡聚合物作為填料裝柱，對(duì)MIPs柱分離條件進(jìn)行優(yōu)化得：

7、上樣液為60％甲醇，淋洗液為去離子水，洗脫液為80％的甲醇/PBS溶液。將埃博霉素B粗提液按照上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行分離純化，最終獲得埃博霉素B純度為(95.8±1.4)%，回收率為(82.5±1.1)%。
　　對(duì)三種工藝路線進(jìn)行比較，凝膠色譜結(jié)合制備型高效液相的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)埃博霉素的分離純化能夠達(dá)到較高的純度，可達(dá)到99%以上，但純度較低為(75.5±0.7)%，且其填料相對(duì)較貴為11400元/500g，分離純化操作需要兩步，相對(duì)來說