腺病毒介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能間充質(zhì)干細胞成骨方向的研究.pdf

1、背景和目的：
　　各種原因造成的骨組織缺損是臨床常見疾患，隨著骨組織工程技術(shù)的興起，給傳統(tǒng)治療難點的骨缺損帶來了一些曙光，組織工程利用自體細胞的生物活性，給予外在因素特定的干擾下將其誘導(dǎo)分化為所需的細胞，從而達到修復(fù)組織的能力。傳統(tǒng)的間充質(zhì)干細胞、胚胎干細胞已在體外成功被誘導(dǎo)定向分化，但涉及到一些倫理、取材限制等問題，因此其在組織學(xué)上作為種子方面的研究受到一定的限制；而隨著體內(nèi)體細胞的研究，通過使用幾個特定的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細胞的重

2、編程而獲得的可不斷自我更新且具有多向分化潛能的誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)的出現(xiàn)，可作為組織學(xué)中理想的種子細胞，本課題在前期已成功將人、山羊、大鼠成纖維細胞誘導(dǎo)為 iPSCs的基礎(chǔ)上，運用誘導(dǎo)因子將山羊 iPSCs定向分化為iPSCs-MSC，作為骨組織工程的優(yōu)化種子細胞，然后利用體外構(gòu)建腺病毒搭載生物因子BMP-2，從而去轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)iPSCs-MSC，探討載體介導(dǎo)下種子細

3、胞轉(zhuǎn)染的可行性，同時觀察研究iPSCs-MSC在生物因子BMP-2的作用下，對其體外增殖和分化成骨能力的影響。
　　方法：
　　1.體外擴增預(yù)先構(gòu)建好的iPSCs-MSC，取傳代至第三代的iPSCs-MSC，按照普通培養(yǎng)基、含BMP-2的培養(yǎng)基、腺病毒-BMP-2的培養(yǎng)基對其進行體外繁殖，而分別設(shè)定為空白對照組、陰性對照組和實驗組，然后分別往各組加入成骨誘導(dǎo)液，在體外進行培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d用CCK-

4、8試劑檢測iPSCs-MSC的存活及增殖活性；
　　2.三組處理好的細胞，轉(zhuǎn)染后，分別于3、7、14天后終止培養(yǎng)，利用堿性磷酸酶試劑盒檢測其堿性磷酸酶表達情況；
　　3.然后在三組細胞培養(yǎng)增殖至20天后，使用茜素紅染液，然后分別于染色后1周、2周后用光學(xué)顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成；
　　4.使用 Western Blotting法測定三組細胞，檢測轉(zhuǎn)染后BMP-2的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.CCK-8

5、檢測后，實驗組細胞的可見光吸收度 OD高于另外兩項對照組，說明實驗組中細胞增殖能力活性明顯強于另外兩組；
　　2.腺病毒轉(zhuǎn)染后的三組細胞ALP測定呈陽性反應(yīng)，且細胞內(nèi)ALP活性隨著時間的延長而增加，但是實驗組中ALP含量明顯高于另外兩組，同時隨著時間延長，陰性對照組較空白對照組也表現(xiàn)出強ALP表達能力；
　　3.實驗組紅色礦化結(jié)節(jié)含量明顯，陰性對照組礦化結(jié)節(jié)表達稍高于空白對照組，空白對照組未見明顯紅色結(jié)節(jié)；
　　4.各

6、組細胞轉(zhuǎn)染后，實驗組細胞BMP-2表達明顯高于陰性對照組，陰性對照組表達不明顯，空白對照組未見表達。
　　結(jié)論：
　　1．證實了iPSC-MSCs在體外成骨的可行性；
　　2.說明了體外生物因子BMP-2具有能顯著促進iPSC-MSCs向成骨細胞的分化和功能；
　　3．腺病毒能明顯加快體外BMP-2對iPSC-MSCs向成骨細胞的分化速率；
　　4．BMP-2基因轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)性多能間充質(zhì)干細胞后在體外可明顯促進