SelK對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、目的：
　　SelK是一種存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的大小為11kd的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜硒蛋白，它在淋巴組織和許多類免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平相對(duì)較高。本研究通過干擾抑制SelK的表達(dá)和體外加硒促進(jìn)SelK的表達(dá)兩方面入手，以探究SelK對(duì)巨噬細(xì)胞增殖、吞噬、遷移能力和細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響，為進(jìn)一步探究SelK在巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用以及如何提高巨噬細(xì)胞中SelK的水平提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　首先構(gòu)建SelK慢病毒干擾

2、巨噬細(xì)胞株，并將巨噬細(xì)胞分為正常對(duì)照組（Mф）、空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組（Mф-NC）、SelK慢病毒干擾組（Mф-siSelK）以及硒代蛋氨酸(Se-Met)處理組。用含10％胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，然后采用多種實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)對(duì)巨噬細(xì)胞的多項(xiàng)免疫功能進(jìn)行檢測。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
　?。≧T-PCR)來檢測巨噬細(xì)胞中β-actin、Se1K、IL-6和IFN-γ的mRNA水平；采用蛋白質(zhì)免疫印跡技

3、術(shù)來檢測SelK蛋白水平、采用CCK-8法來檢測巨噬細(xì)胞的增殖水平；用巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞法來檢測巨噬細(xì)胞的吞噬能力；用transwell小室法來檢測巨噬細(xì)胞的穿孔遷移能力；用酶聯(lián)免疫吸附測定法來檢測巨噬細(xì)胞分泌的IL-6和IFN-γ的水平變化；用細(xì)胞免疫熒光法觀察SelK在巨噬細(xì)胞中的位置。
　　結(jié)果：
　　1.與Mф-NC組相比，Mф-siSelK組SelK mRNA和蛋白的水平、巨噬細(xì)胞的增殖、吞噬和遷移能力顯著降低，

4、并且巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-6和IFN-γ的分泌量也顯著減少。
　　2.濃度為1μmol/L Se-Met在處理巨噬細(xì)胞24 h和48h后，能顯著性地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖（**P<0.01)；濃度為100μmol/L Se-Met在處理巨噬細(xì)胞48 h后，能極顯著性地抑制巨噬細(xì)胞增殖（**P<0.01)。
　　3.1μmol/L Se-Met能使巨噬細(xì)胞中SelK的mRNA水平顯著增加（24 h處理組，*P<0.05；48 h

5、處理組，**P<0.01），另外，SelK蛋白的表達(dá)量也有所增加（48 h處理組，*P<0.05）。
　　4.在巨噬細(xì)胞中，SelK蛋白所在的區(qū)域與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物KDEL所在的區(qū)域重疊。
　　結(jié)論：
　　1. SelK基因沉默能降低小鼠巨噬細(xì)胞的增殖、吞噬和遷移能力以及巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-6和IFN-γ的表達(dá)量。
　　2.濃度為1μmol/L的 Se-Met能夠促進(jìn)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SelK的表達(dá)和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的