褪黑素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞釋放的外泌體對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，死亡率排第五，并且具有高耐藥性和缺乏有效的治療方法。盡管過去的幾十年出現(xiàn)很多先進(jìn)的治療方法但還是有很多人死于肝癌。外科手術(shù)是非常有效的治療方法，但很多的患者診斷時已失去了手術(shù)機(jī)會。全身性化療是晚期肝癌患者的主要治療方法，但不論是單藥還是多藥聯(lián)合治療效果均不理想。傳統(tǒng)的治療方法似乎已經(jīng)達(dá)到了平臺期。因此，如何提高HCC

2、治療效果是當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn)。目前臨床腫瘤免疫治療取得一系列突破，明確藥物相關(guān)免疫作用及機(jī)制，為其更好地應(yīng)用于臨床提供有力依據(jù)，最終達(dá)到提高治療效果，延長患者生存期的作用，具有很重要的意義。
　　腫瘤微環(huán)境（tumor microenviroment）通常是由多種不同細(xì)胞構(gòu)成，主要包括腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等）組成，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。免疫細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中起著至關(guān)重要的

3、作用，通過免疫監(jiān)視，免疫清除維持機(jī)體的正常穩(wěn)定。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞會影響微環(huán)境的功能從而引起免疫抑制狀態(tài)以應(yīng)對惡劣的生存條件，維持自身生存。
　　巨噬細(xì)胞是一種調(diào)節(jié)性很強(qiáng)的細(xì)胞，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持機(jī)體免疫狀態(tài)等方面具有重要作用。多種研究表明，巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分之一，且腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在多種因素的作用下常常會發(fā)生表型變化，轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated mac

4、rophage，TAM），TAM的功能會發(fā)生改變，可以引起微環(huán)境中免疫狀態(tài)的改變，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲遷移等促腫瘤作用。然而，腫瘤細(xì)胞通過何種途徑使原來具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咭种频木奘杉?xì)胞從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，能否通過褪黑素影響該途徑從而減輕這種腫瘤導(dǎo)致的免疫抑制機(jī)制尚不清楚。Exosome是一類直徑大約為30-100nm的圓形或類圓形囊泡樣結(jié)構(gòu)，其包含有大量物質(zhì)，在細(xì)胞間信號傳遞中發(fā)揮重要作用。因此，深入研究微環(huán)

5、境中的腫瘤細(xì)胞影響巨噬細(xì)胞，進(jìn)而改變其免疫功能具有重要的臨床意義。本課題擬探討褪黑素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞外泌體能否影響巨噬細(xì)胞的免疫功能及可能的分子機(jī)制。
　　目的：
　　通過將處于褪黑素誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞釋放的exosome與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察巨噬細(xì)胞PD-L1(程序性死亡配體)及炎癥因子的表達(dá)狀況，了解褪黑素作用的肝癌細(xì)胞對巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。并通過研究相關(guān)的 STAT3信號通路，進(jìn)一步研究褪黑素誘導(dǎo)的肝癌exoso

6、me調(diào)控巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)的具體機(jī)制。
　　方法：
　　(1)使用0.1mM的褪黑素與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)24小時，分別收集 MT處理組（Exo-MT）和未處理組細(xì)胞（Exo-con）的上清液，使用ExoQuick-TC試劑盒提取 exosome，透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope,TEM）觀察exosome的形態(tài)、大小，Western-Blot方法檢測exosomes標(biāo)志蛋白CD

7、63、TSG101以及分子伴侶蛋白Calnexin的表達(dá)。
　　(2)使用膜染料PKH67標(biāo)記exosome，然后將PKH67標(biāo)記的exosomes與巨噬細(xì)胞共同孵育或尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，12h后共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬exosome的情況。
　　(3)將不同的exosome（Exo-con和Exo-MT）與THP-1巨噬細(xì)胞（經(jīng)100ng/ml PMA誘導(dǎo)48小時所得）共培養(yǎng)24小時，分別收集細(xì)胞和上清液，使用流式細(xì)

8、胞儀檢測PD-L1表達(dá)，CBA細(xì)胞因子試劑盒檢測炎癥因子表達(dá)。
　　(4)分別對裸鼠尾靜脈注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-MT，隔日一次，共10次。注射結(jié)束后24h，處死裸鼠收集腹腔巨噬細(xì)胞，貼壁2小時后換液棄去未貼壁細(xì)胞，剩余細(xì)胞培養(yǎng)過夜后收集細(xì)胞和上清液，流式細(xì)胞儀檢測 PD-L1和炎癥因子的表達(dá)。
　　(5)分別收集Exo-con和Exo-MT與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時后的細(xì)胞，提取總蛋白，We

9、stern-Blot方法檢測STAT3與p-STAT3等蛋白水平變化。
　　(6)使用STAT3抑制劑抑制巨噬細(xì)胞STAT3表達(dá)，Western-Blot方法檢測STAT3通路蛋白變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測抑制后THP-1巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)透射電鏡可見收集到的外泌體呈圓形或類圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu)，直徑為30-100nm，符合外泌體的典型特征。Western-Blot檢測顯示所得的“exosom

10、e”表達(dá)CD63，但不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白Calnexin，進(jìn)一步證明上清中收集到的是不含細(xì)胞成分的外泌體。BCA蛋白定量法對所得外泌體總蛋白進(jìn)行定量，結(jié)果表明MT作用24h后肝癌細(xì)胞分泌的外泌體無明顯增加。
　　(2)激光共聚焦顯微鏡顯示，PKH67標(biāo)記的外泌體能夠被 THP-1巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞所攝取，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證明腹腔巨噬細(xì)胞能夠攝取 PKH67標(biāo)記的外泌體。
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化結(jié)果均顯示，

11、與對照組和 Exo-con組相比，Exo-MT可明顯下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞PD-L1。CBA炎癥因子檢測結(jié)果顯示，Exo-con可上調(diào)IL-1β，IL-6，IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，Exo-TM則可以下調(diào)這些細(xì)胞因子的表達(dá)。類似的，將Exo-con和Exo-MT通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，Exo-con注射小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)也明顯上升，且細(xì)胞上清中的IL-6，IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)明顯升高,而E

12、xo-MT組則明顯下降。
　　(4) Western-Blot檢測顯示Exo-MT與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時后能顯著下調(diào)p-STAT3蛋白水平。而Exo-con則明顯上調(diào)了p-STAT3蛋白的表達(dá)。提示外泌體可能是通過STAT3信號通路調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)。
　　(5)使用STAT3抑制劑使THP-1巨噬細(xì)胞STAT3蛋白明顯下調(diào)，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，抑制劑能夠明顯降低Exo-con作用下THP-1巨噬細(xì)胞的PD