hBMP-2和Ad-hBMP-2對(duì)體外培養(yǎng)人退變腰椎間盤細(xì)胞促合成代謝作用的研究.pdf

1、椎間盤退變是一系列脊柱退行性疾病的根本病理基礎(chǔ)，其結(jié)局往往是椎管狹窄、脊柱節(jié)段不穩(wěn)、骨贅形成、腰腿痛、頸椎病、椎間盤突出及隨之而來的神經(jīng)根、脊髓受壓等等，臨床發(fā)病廣，病情復(fù)雜。盡管目前廣泛認(rèn)為椎間盤變性是細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)共同作用的結(jié)果，但人們對(duì)椎間盤變性的機(jī)制并不清楚。細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)變化主要表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量的減少和Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因表達(dá)產(chǎn)物的下降。隨椎間盤變性發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)合成下降，結(jié)果導(dǎo)致椎間盤疾病發(fā)生。近年隨分子生物學(xué)發(fā)展，例如

2、基因重組和基因克隆技術(shù)發(fā)展，可以得到大量的純基因產(chǎn)物(RNA和蛋白質(zhì))應(yīng)用于試驗(yàn)和臨床工作。應(yīng)用生物治療合成蛋白多糖和Ⅱ型膠可原有效的延緩或逆轉(zhuǎn)椎間盤變性的過程。 hBMP-2是骨形態(tài)蛋白家族中的一員，能促進(jìn)細(xì)胞合成代謝。本研究是探討不同濃度hBMP-2人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2腺病毒表達(dá)載體(Ad-hBMP-2)對(duì)體外培養(yǎng)人退變腰椎間盤細(xì)胞影響，為進(jìn)一步hBMP-2基因治療椎間盤退變奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法：

3、1.腰椎間盤細(xì)胞分離培養(yǎng) 取成年人腰椎間盤突出癥患者手術(shù)切除退變椎間盤18個(gè)。無菌分離椎間盤中髓核組織，用剪刀把髓核組織剪成1mm3組織塊，組織塊在0.2％胰酶和0.02％Ⅱ型膠原酶消化，細(xì)胞在37℃潮濕的含5％CO2孵箱中培養(yǎng)，每周更換細(xì)胞培養(yǎng)液2次。 2.Ⅱ型膠原表達(dá) 細(xì)胞爬片，采用過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素進(jìn)行免疫細(xì)胞學(xué)染色。3.aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá) 椎間盤細(xì)胞生長基本融合60％-70％，分

4、別加入0ng/ml，10ng/ml和100ng/mlhBMP-2，在加入hBMP-2后第3d和第6d分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用ELISA法定量檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá)。 4.aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá) 椎間盤細(xì)胞生長基本融合60％-70％，分別加入0ng/ml，10ng/ml和100ng/mlhBMP-2，在加入hBMP-2后第6d分別收集培養(yǎng)細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原

5、mRNA表達(dá)。 5.Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染腰椎間盤細(xì)胞 待細(xì)胞生長至70～80％融合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，根據(jù)同等條件下計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)加人Ad-hBMP-24h。含20％血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，檢測(cè)指標(biāo)。 6.轉(zhuǎn)染后椎間盤細(xì)胞鑒定 細(xì)胞爬片、轉(zhuǎn)染，采用免疫細(xì)胞染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Ⅱ型膠原表達(dá)。待細(xì)胞生長至70～80％融合時(shí)，根據(jù)同等條件下計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)加入Ad-hBMP-2(150MOI)4h。繼續(xù)培養(yǎng)3d，基本融合前

6、12h加入秋水仙素，收集細(xì)胞檢測(cè)染色體數(shù)目。 7.X-gal免疫染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 細(xì)胞爬片，待細(xì)胞生長至70％～80％融合時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，根據(jù)同等條件下計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)加入Ad-Lacz(50MOI)4h，X-gal免疫染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 8.轉(zhuǎn)染后目的蛋白的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分別用免疫熒光和WesternBlot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞BMP-2的表達(dá)。 9.轉(zhuǎn)染后aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá)

7、 椎間盤細(xì)胞生長基本融合60％-70％，分別加入0MOI，50MOI，100MOI，150MOI的Ad-hBMP-2，在加入Ad-hBMP-2后第3d和第6d分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。ELISA法定量檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá)。 10.轉(zhuǎn)染后aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá) 椎間盤細(xì)胞生長基本融合60％-70％，分別加入0MOI，50MOI，100MOI，150MOI的Ad-hBMP-2，在加入Ad-hBM

8、P-2后第6d分別收集培養(yǎng)細(xì)胞，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)。 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。SPSS12.0軟件進(jìn)行one-wayANOVA分析，用q檢驗(yàn)比較組間差異，以P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.腰椎間盤細(xì)胞鑒定 腰椎間盤細(xì)胞表現(xiàn)為多角型、星形，中央有圓形核，胞質(zhì)內(nèi)可見分泌顆粒。分泌Ⅱ型膠原是椎間盤細(xì)胞的功能

9、，在第二代進(jìn)行的免疫細(xì)胞學(xué)染色顯示存在分泌Ⅱ型膠原功能。 2.ELISA檢測(cè)aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá)結(jié)果 BMP-2組aggrecan和Ⅱ型膠原表達(dá)與對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)，并且隨劑量增高aggrecan和Ⅱ型膠原的表達(dá)量逐漸增加。 3.aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的合成 BMP-2組(10ng/ml組和100ng/ml組)aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組，并且

10、隨劑量增高aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)量逐漸增加。 4.腰椎間盤細(xì)胞轉(zhuǎn)染后形態(tài)變化 在第二代Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組生長旺盛。免疫細(xì)胞學(xué)染色顯示存在分泌Ⅱ型膠原功能。染色體分析細(xì)胞的染色體數(shù)目23對(duì)，未出現(xiàn)多倍體及異倍體。 5.Ad-hBMP-2在腰椎間盤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 對(duì)照病毒Ad-LacZ轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞編碼產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，與底物X-gal反應(yīng)生成藍(lán)色，特異性染色結(jié)果

11、顯示：腰椎間盤細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染效率接近100％。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的hBMP-2免疫熒光顯示對(duì)照組為陰性，陽性組從50MOI組到150MOI組熒光逐漸增強(qiáng)。Westernblot檢測(cè)顯示Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染組有hBMP-2陽性條帶，陽性組從50MOI組到150MOI組條帶逐漸增強(qiáng)。未轉(zhuǎn)染組和Ad-LacZ轉(zhuǎn)染組150MOI呈陰性。 6.Ⅱ型膠原和aggrecan的合成 轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后第3d和第6d各組OD值顯示轉(zhuǎn)染組O

12、D值高于對(duì)照組，并且隨轉(zhuǎn)染劑量增高，Ⅱ型膠原和aggrecan合成量逐漸增加。 7.aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后第6d，轉(zhuǎn)染組aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)高于對(duì)照組，并且隨轉(zhuǎn)染劑量增高，aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達(dá)量逐漸增加。 結(jié)論： 1.hBMP-2能促進(jìn)Ⅱ型膠原和aggrecan合成，并且存在劑量依賴關(guān)系。 2.hBMP-2能促進(jìn)Ⅱ型膠

13、原和aggrecanmRNA合成，并且存在劑量依賴關(guān)系。 3.Ad-hBMP-2可以成功進(jìn)入腰椎間盤細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，并不影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。 4.Ad-hBMP-2轉(zhuǎn)染腰椎間盤細(xì)胞，從50MOI組到150MOI組逐漸增加目的蛋白表達(dá)，并有良好的劑量關(guān)系。 5.轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后各轉(zhuǎn)染組Ⅱ型膠原和aggrecan合成量高于對(duì)照組，并且隨轉(zhuǎn)染劑量增高。 6.轉(zhuǎn)染Ad-hBMP-2后各轉(zhuǎn)染組Ⅱ型膠原和a