Tet-On系統(tǒng)調(diào)控的hBMP-2表達(dá).pdf

1、研究目的: 構(gòu)建包含hBMP-2目的基因的Tet-On表達(dá)系統(tǒng)，在低劑量DOX誘導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對hBMP-2高水平調(diào)控表達(dá)，DOX誘導(dǎo)與hBMP-2分泌呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，為骨缺損的修復(fù)提供足夠量的成骨因子；為解決成骨與生物材料降解不同步的矛盾提供部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法: 1．測序證實(shí)pcDNA3.1-hBMP2質(zhì)粒上包含的hBMP2基因?yàn)槟康幕?，利用限制性核酸?nèi)切酶XbaI從該載體上獲得hBMP-2全長ORF。

2、 2．先用XbaI從pTRE-Shuttle2的多克隆位點(diǎn)將其切開并去磷酸化，再用T4DNA連接酶將hBMP-2基因片段插入到pTRE-Shuttle2的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組的pTRE-Shuttle2-hBMP 2載體；在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后鑒定，篩選出正向連接克隆載體；用PI-SceI/I-CeuI消化制備出重組的pTRE-Shuttle2-hBMP2線性化DNA片段。 3．用T4DNA連接酶將pTRE-Shutt

3、le2-hBMP2線性化DNA片段定向克隆到BDAdeno-X System l Viral DNA上，構(gòu)建重組的Adeno-X-TRE-hBMP2載體；在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后篩選鑒定；用PacI內(nèi)切酶消化構(gòu)建線性化重組的Adeno-X-TRE-hBMP2 DNA片段。再次利用大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化擴(kuò)增并篩選鑒定。 4．將重組的Adeno-X-TRE-hBMP2 DNA片段與Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染H

4、EK293包裝細(xì)胞，獲得有感染能力重組腺病毒顆粒。 5．BD Adeno-X TRE-β gal Control Virus Stock和BD Adeno-X Tet-On virus Stock感染HEK293包裝細(xì)胞擴(kuò)增病毒；96孔板法感染HEK293細(xì)胞檢測病毒滴度。 6．通過對照組Adeno-X TRE-β gal與Adeno-X Tet-On病毒上清共感染BMSCs7．在最佳MOI條件下，用重組的Adcno-X

5、-TRE-hBMP2與Adcno-X- Tet-On病毒上清共感染BMSCs，在上清中加入不同濃度(0.0001 ug/na、0.001 ug/na、0.01 ug/na、0.1 ug/na、1.0 ug/ml和10ug/ml)的DOX誘導(dǎo)hBMP-2表達(dá)，然后通過RT-PCR和WESTERN BLOTING檢測hBMP-2的表達(dá)，并用ELISA檢測DOX誘導(dǎo)濃度與hBMP-2表達(dá)量之間的量效關(guān)系。 結(jié)論: 本研究成功構(gòu)