中國(guó)明對(duì)蝦先天免疫的模式識(shí)別與效應(yīng)分子.pdf

1、本研究通過(guò)淘選噬菌體展示文庫(kù)、同源克隆和抑制性消減雜交的方法從中國(guó)明對(duì)蝦中分別克隆得到了圍食膜蛋白基因、脂多糖-β-1，3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)和三種抗菌肽(crustin)基因，并對(duì)這些基因的性質(zhì)做了進(jìn)一步研究。這些研究使我們對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦免疫的模式識(shí)別和效應(yīng)分子有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。 一、中國(guó)明對(duì)蝦圍食膜蛋白基因克隆和性質(zhì)研究我們用弧菌和金黃色葡萄球菌刺激中國(guó)明對(duì)蝦以后，提取其血細(xì)胞的總RNA。再提取mRNA后用其構(gòu)建了T7

2、噬菌體展示文庫(kù)。選擇了多種配體來(lái)進(jìn)行文庫(kù)淘選，在用大腸桿菌經(jīng)過(guò)3輪淘選以后獲得了一段圍食膜蛋白的基因。在這一片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)基因特異性引物利用RACE和SMART cDNA技術(shù)獲得了基因的全長(zhǎng)。中國(guó)明對(duì)蝦圍食膜蛋白基因(Fc-PTPH)全長(zhǎng)為1028bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?22bp，共編碼274個(gè)氨基酸?；虻?’端含有17bp的非編碼區(qū)，3’端含有209bp的非編碼區(qū)。這一基因編碼的蛋白為30.6kDa，其理論等電點(diǎn)為4.92。蛋白前20

3、個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，其含有4個(gè)圍食膜蛋白A樣結(jié)構(gòu)域(peritrophinA-like domains)，經(jīng)過(guò)SMART預(yù)測(cè)，其中后三個(gè)為幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(chitin-binding domains，CBDs)。 通過(guò)Northern blot和RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-PTPH組成性高表達(dá)于卵巢中，在肝胰腺中沒(méi)有表達(dá)，而在其它組織(血細(xì)胞、心、胃、鰓、腸、精巢)中細(xì)菌刺激才能誘導(dǎo)這一基因的表達(dá)。我們還用Northern

4、blot方法研究了Fc-PTPH在腸和卵巢中細(xì)菌刺激后不同時(shí)間的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在腸中刺激16小時(shí)后能夠檢測(cè)到基因的表達(dá)，在24小時(shí)時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高。而在卵巢中，在刺激后不同時(shí)間Fc-PTPH的表達(dá)沒(méi)有變化，一直維持著高表達(dá)模式。原位雜交顯示這一基因的mRNA存在于顆粒血細(xì)胞和卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。設(shè)計(jì)了成熟肽表達(dá)引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后連入pET-30a(+)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)。由于表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體，所

5、以只有經(jīng)過(guò)變性復(fù)性后，才能利用His-Bind親和層析柱進(jìn)行純化。利用純化的蛋白作為抗原刺激家兔獲得了多克隆抗血清，免疫雙擴(kuò)散顯示抗體滴度可以達(dá)到8倍稀釋。Westernblot檢測(cè)也能獲得清晰、特異的條帶。 二、中國(guó)明對(duì)蝦脂多糖-β-1，3-葡聚糖(LGBP)基因克隆和性質(zhì)研究根據(jù)相近物種的同一類(lèi)基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)兼并引物，巢式PCR后獲得了中國(guó)明對(duì)蝦LGBP基因(Fc-LGBP)的中間片段，再根據(jù)這一片段設(shè)計(jì)引物從血細(xì)胞SMAR

6、T cDNA中克隆得到了基因全長(zhǎng)?；蛉L(zhǎng)為1253bp，包含1101bp的開(kāi)放閱讀框。在基因的5'端含有7bp的非編碼區(qū)，3'端含有129bp的非編碼區(qū)。這一基因編碼的蛋白質(zhì)由366個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。預(yù)測(cè)成熟肽分子量為39.8kDa，等電點(diǎn)為4.43。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)，中國(guó)明對(duì)蝦LGBP含有兩個(gè)N糖基化位點(diǎn)和一個(gè)細(xì)胞粘連位點(diǎn)(Arg-Gly-Asp，RGD)。從蛋白94位氨基酸至312位氨基酸是一個(gè)糖基水解酶結(jié)

7、構(gòu)域。 選取正常及細(xì)菌刺激的血細(xì)胞、心、肝胰腺、胃、鰓、腸的總RNA進(jìn)行Northern blot分析，結(jié)果顯示Fc-LGBP僅表達(dá)于血細(xì)胞中，細(xì)菌刺激24小時(shí)后基因表達(dá)量下降。這一結(jié)果在RT-PCR中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，但是由于RT-PCR更靈敏一些，還可以在肝胰腺和鰓中檢測(cè)到基因的表達(dá)，但是其表達(dá)很弱。我們選取了多種組織來(lái)研究Fc-LGBP基因表達(dá)的組織定位，原位雜交顯示Fc-LGBP基因的mRNA只存在于顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

8、 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)成熟肽表達(dá)引物，將基因片段克隆到載體pET-30a(+)中，轉(zhuǎn)化其感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核表達(dá)。重組表達(dá)的蛋白也形成包涵體，變性、復(fù)性以后用His-Bind親和柱進(jìn)行純化。利用重組表達(dá)并純化的LGBP作為抗原免疫家兔，9周后獲得多克隆抗血清。 在獲得了LGBP多克隆抗體以后，我們研究了LGBP蛋白在不同組織中的分布。首先利用免疫組化的方法研究了LGBP的組織定位，一抗反應(yīng)后，再用FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG檢測(cè)

9、，在熒光顯微鏡下可以觀察到LGBP蛋白定位于絕大多數(shù)血細(xì)胞的細(xì)胞膜上，形成顆粒狀的熒光信號(hào)。利用多克隆抗體，我們還研究了LGBP蛋白在對(duì)蝦各組織中的表達(dá)模式。將對(duì)蝦各組織(血漿、血細(xì)胞、心、肝胰腺、鰓)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜后，用LGBP多克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記，再用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG進(jìn)行二抗標(biāo)記，顯色后發(fā)現(xiàn)，天然的LGBP蛋白主要存在于血細(xì)胞中，在肝胰腺也有較弱的表達(dá)，天然蛋白的分子量約為40kDa。在其它組織中則沒(méi)有

10、檢測(cè)到蛋白的存在。 三、中國(guó)明對(duì)蝦三種甲殼肽(crustin)類(lèi)抗菌肽的基因克隆和性質(zhì)研究我們?cè)谥袊?guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞抑制性消減雜交(suppression subtractivehybridization，SSH)文庫(kù)測(cè)序的EST中發(fā)現(xiàn)了一段序列與erustin基因相似，根據(jù)這段序列設(shè)計(jì)特異性前引物從血細(xì)胞SMART-cDNA中獲得了基因的3’端，又設(shè)計(jì)特異性后引物，獲得了基因5’端的部分序列，將此基因命名為Fc-crustin Ⅰ

11、。在擴(kuò)增Fc-crustin Ⅰ的5’端時(shí)，獲得的片段與已經(jīng)獲得的Fc-crustin Ⅰ的部分序列除引物外不能完全重疊，便命名為Fc-crustin Ⅱ；根據(jù)這一基因片段設(shè)計(jì)基因特異性引物，獲得了Fc-crustin Ⅱ基因的完整序列。在Fc-crustin Ⅰ 3’端克隆時(shí)，在卵巢組織中獲得的片段與預(yù)期大小不一致，將其克隆測(cè)序后是一條具有完整的3，端的EST，BLAST結(jié)果顯示其與crustin具有較高的同源性，便命名為Fe-cru

12、stinⅢ；根據(jù)Fc-crustin Ⅲ的這一序列設(shè)計(jì)引物獲得了這一基因的全序列。 已經(jīng)獲得的Fc-crustin Ⅰ部分基因序列含有完整的乳清酸性蛋白(whey acidicprotein，WAP)結(jié)構(gòu)域，位于基因的3’端由49個(gè)氨基酸構(gòu)成。 Fc-crustin Ⅱ基因全長(zhǎng)473bp，包含一個(gè)390bp的開(kāi)放閱讀框，編碼130個(gè)氨基酸。在基因的5’端有4bp的非編碼序列，3’端的非編碼序列為79bp。通過(guò)ExPASy

13、網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)，這一基因編碼的蛋白分子量為14.0kDa，其理論等電點(diǎn)為8．60。蛋白前17個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，蛋白C端83.124位氨基酸形成WAP結(jié)構(gòu)域。 Fc-crustin Ⅲ基因全長(zhǎng)為574bp，其開(kāi)放閱讀框?yàn)?62bp，共編碼154個(gè)氨基酸。基因5’端和3’端的非編碼區(qū)分別為38bp和74bp。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)Fc-crustinⅢ基因編碼的蛋白分子量為17.79kDa，其理論等電點(diǎn)為4.64。前20個(gè)氨基酸形成信號(hào)肽，62-1

14、27位氨基酸構(gòu)成WAP結(jié)構(gòu)域。 選取正常及細(xì)菌刺激24小時(shí)中國(guó)明對(duì)蝦血細(xì)胞、心、肝胰腺、胃、鰓、腸、卵巢和精巢組織，利用RT-PCR方法分析三種crustin基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示Fc-crustin I基因廣泛表達(dá)于各種組織，在血細(xì)胞中表達(dá)量最高，精巢中表達(dá)量最低。在多數(shù)組織中細(xì)菌刺激前后Fc-crustin Ⅰ表達(dá)變化不大，但是在胃中刺激后表達(dá)上調(diào)比較明顯。Fc-crustin Ⅱ也廣泛表達(dá)于各種組織中，在各組織中的表達(dá)差

15、異與Fc-erustin I相似，在血細(xì)胞中的表達(dá)量最高。細(xì)菌刺激后在心、鰓、卵巢組織中表達(dá)上調(diào)比較明顯，而在其它組織中，刺激前后表達(dá)變化不大。Fc-crustinⅢ的表達(dá)模式同Ⅰ和Ⅱ差別比較大，F(xiàn)c-crustin Ⅲ只表達(dá)于少數(shù)幾種組織中，包括正常心、刺激胃、正常卵巢和刺激卵巢。另外，在刺激的心和腸中有少量表達(dá)。在其余組織中則沒(méi)有檢測(cè)到Fc-crustin Ⅲ基因的表達(dá)。 設(shè)計(jì)成熟肽表達(dá)引物，將Fc-crustin Ⅱ和Fc

16、-crustin Ⅲ分別克隆入pET-30(+)，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)。利用His-Bind親和柱純化以后檢測(cè)其抑菌活性，結(jié)果表明原核重組表達(dá)的Fc-crustin Ⅱ和Fc-crustin Ⅲ的成熟肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都沒(méi)有抑制活性。又重新設(shè)計(jì)表達(dá)前引物，將信號(hào)肽一起進(jìn)行原核重組表達(dá)，用管碟法檢測(cè)后，F(xiàn)c-crustin Ⅲ重組表達(dá)蛋白的抑菌活性沒(méi)有檢測(cè)到，而Fc-crustin Ⅱ?qū)μ冱S微球菌和金黃色葡萄球菌兩種革