中國對蝦Fenneropenaeus chinensis先天免疫相關(guān)基因克隆與表達(dá)研究.pdf

1、山東大學(xué)博十學(xué)位論文原 創(chuàng) 性 聲 明本人鄭重聲明:所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已 在文中以明 確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名: 科 議 日 期:) 討 護(hù) W 2 - 0關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了 解山東大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位

2、論文的規(guī)定，同 意學(xué)校保留或向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱;本人授權(quán)山東大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi) 容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文和匯編本學(xué)位論文。( 保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定)論 文 作 者 簽 名 : 霖那 i t ,導(dǎo)師簽名 魚 洗 日期:> , k o 4 . 4 p . i o山東大學(xué)博十學(xué)位論文端 含 有 對 蝦 素 基 因 所

3、特 有 的6 個(gè)半 膚 氨 酸 殘 基 和 結(jié) 合 幾 丁 質(zhì) 基 元 結(jié) 構(gòu)。 C h p 3 - 2 是。p 3一 1 基因 的 同 工 型( i s o f o r m ) ， 只是 成 熟 膚的 第3 個(gè) 氨基 酸與C h p 3 - 1 不同 。 C h p 5 - 1 基因與 前面兩個(gè)基因 成熟 膚氨基酸 序列差異 性很 大。 理論等電 點(diǎn)9 . 5 5 ， 分子 量為6 4 4 6 . 5 D a ， 共有1 0 個(gè)帶正電

4、 荷的 氨基酸 ( 8 個(gè)A r g 和2 個(gè)L y s ) , 3 個(gè)帶負(fù)電 荷的 氨基酸 ( 3 個(gè)A s p ) .具有抗菌膚所固有的主要特征，也有 6 個(gè)半膚氨酸殘基。以 對蝦基因組 D N A為模板， 用特異性引物進(jìn)行 P C R 擴(kuò)增，然后進(jìn)行克隆，測序。又得到 一種抗 菌膚新 基因， 與C h p 5 - 1 基因 有兩個(gè) 氨基酸的 差異， 分別在信號 膚的 第1 0位和成熟 膚的 第 3 9 位， 被 命名為。 i p

5、 5 - 2 基因，同時(shí) 證明中 國 對 蝦抗菌 膚基因。p 5 - 2含有6 0 8 b p 的 一個(gè)內(nèi) 含子。利用分子系統(tǒng)學(xué)的方法， 將來 自 不同物種的對蝦素 ( 基因庫登錄的對蝦素和我們克隆得到的4 種對蝦素)的氨基酸序列進(jìn)行分析，并根據(jù)不同對蝦素的關(guān)鍵氨基酸及在序列中所處的位置，可以將來 自不同種對蝦的對蝦素分為P e n a e i d i n - 2 , P e n a e i d i n - 3 ,P e n a e

6、i d i n - 4 和 P e n a e i d i n - 5 四 個(gè)亞 類群。 中 國 對 蝦素 。p 3 - 1 和 。p 3 - 2 是 對 蝦素 3 亞 類的 新 成員， 另外兩種對蝦素基因既有與對蝦素2 相似的關(guān)鍵氨基酸， 又有與對蝦素3 相似的關(guān)鍵氨基酸， 同時(shí)又有自己 特有的氨基酸， 分子系統(tǒng)學(xué)分析它們歸為一類， 故將其作為一新亞類群， 稱為對蝦素一 5 ( P e n a e i d i n - 5 ) ,團(tuán)此

7、將來自 中國對蝦的這兩種對蝦素分別稱為C h - p e n a e i d i n s 5 - 1 , C h - p e n a e i d i n s 5 - 2 ， 簡 稱為 。 i p 5 - 1 和 。 i p 5 - 2 0二、 利用R T - P C R , N o r t h e r n B l o t ， 原 位雜交和免疫組織化學(xué)等方法， 對C h - p e n a e i d i n在正常中國對蝦中的表達(dá)

8、和分布進(jìn)行了研究。采用N o r t h e r n b l o t 分析了 對蝦血細(xì)胞和其它各組織中 對蝦素的 表達(dá)情況， 結(jié) 果顯示， 血細(xì)胞中雜交帶非常明顯， 這說明對蝦素基因在血細(xì)胞中是高豐度表達(dá)的。 在檢測的其它組織中也有對蝦素基因m R N A 的 存在， 在鰓， 心臟和腸中表達(dá)量較高。 對蝦素在對蝦體內(nèi)的表達(dá)也用R T - P C R 的方法進(jìn)行了研究。與N o r t h e r n b l o t 相比， R T

9、- P C R 反應(yīng)的靈敏性較高， 所以， 在檢測的所有組織 ( 鰓、 心臟、 肝胰腺、 眼、 表皮、 腦、 腸、胃 和血細(xì)胞)中都可以見到有對蝦素基因的表達(dá)， 只是強(qiáng)度不同， 血細(xì)胞中的 表達(dá)量最高。原位雜交結(jié)果顯示， 不同的 血細(xì)胞類群對c R N A探針有不同的 著色強(qiáng)度。 顆粒血細(xì)胞中可見較強(qiáng)的陽性反應(yīng)。 在鰓組織的血管頂端的細(xì)胞和二級鰓絲結(jié)構(gòu)中 可見有對蝦素基因的轉(zhuǎn)錄。 對照中沒有陽 性反應(yīng)。 對蝦表皮， 尤其是表皮的 里層中