漢族人群線粒體基因單倍型類群與重度膿毒血癥發(fā)病和預后的相關性研究.pdf

1、重度膿毒血癥是指膿毒血癥合并有器官功能障礙，與之相關的多器官功能障礙是目前重癥患者的最常見的死因。膿毒血癥導致多器官功能障礙的具體發(fā)病機制目前還不清楚，一般認為有多種因素發(fā)揮了作用，如微循環(huán)障礙、氧代謝紊亂、凋亡異常、細胞因子和其他膿毒血癥相關因素的直接細胞毒作用等。近來，大量研究顯示，細胞間氧利用障礙，即所謂“Cytopathic hypoxia”，在重度膿毒血癥，特別是多器官功能障礙的發(fā)生過程中起了關鍵的作用。機體90％的氧是由線粒

2、體利用的，并產生最主要的能量供應物質三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate，ATP)，以維持細胞正常的生理需要和代謝平衡。電子在定位于線粒體內膜上的一系列呼吸鏈復合體中傳遞，通過氧化磷酸化反應產生ATP。因此，線粒體的功能狀態(tài)很有可能是與重度膿毒血癥、特別是多器官功能障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關的。 線粒體為一“半自主”細胞器，含有自身的DNA物質。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)為雙鏈

3、環(huán)狀DNA，全長約16,000堿基對，它包含37個基因，其中2個為rRNA基因，22個為tRNA基因，13個為蛋白質編碼基因，編碼線粒體呼吸鏈復合體上的一系列蛋白。人類mtDNA是嚴格母系遺傳的，并可根據(jù)其編碼區(qū)和控制區(qū)的一些特異性變異，將其分為不同的世系，即mtDNA單倍型類群。大量的研究表明，mtDNA單倍型類群是線粒體功能相關的，可影響線粒體呼吸鏈的活性，并與許多疾病如：帕金森綜合癥(Parkinson disease,PD)、老

4、年性癡呆(Alzheimer disease，AD)、乳腺癌、食管癌等的發(fā)病相關。最近又有學者報道了歐洲主要mtDNA單倍型類群H是重度膿毒血癥的獨立預后因素，發(fā)現(xiàn)屬于此種單倍型類群的患者，相較于非H型的個體具有更好的180天生存率(2.12倍)。雖然不同地域、種族、遺產背景的人群具有不同的mtDNA單倍型類群分布率，我們認為在其他種族中也應該存在類似重度膿毒血癥和mtDNA單倍型類群之間的相關性。這樣的研究，在歐洲和北美人群以外，目前

5、相關的報道非常少。漢族人群是世界上最大的族群，約占中國總人口的93％，世界總人口的20％。大部分的漢族人群mtDNA單被型類群可以歸入三個主要的mtDNA單倍型類群M、N、R(其本身為N型的分支，且為歐亞共同分支)。本研究中，我們通過建立快捷有效的mtDNA單倍型類群分型方法，檢測了570例健康漢族人和相同遺傳背景的181例重度膿毒血癥患者的mtDNA單倍型類群類型，并前瞻性的研究了mtDNA單倍型類群與重度膿毒血癥發(fā)病和預后的相關性。

6、 第一部分： 研究目的：建立快速、可靠、適用于大樣本量研究的mtDNA單倍型分型策略和檢測方法。 材料和方法：選擇浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院體檢中心健康志愿者70例。以線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)高變區(qū)序列分析結合編碼區(qū)特征性變異檢測驗證的分型策略，特征性變異參照升級的東亞人群mtDNA單倍型類群分型樹。以PCR擴增后測序分析作為高變區(qū)序列分析的檢測方法，編碼區(qū)特異性變異檢測則由

7、熒光標記的寡核苷酸探針在Real—time RCR AlleleDiscrimination-SNP’s模式下完成。對于以上述手段完成的mtDNA單倍型類群分型結果，用經典的限制性片段長度多態(tài)性分析(Restriction fragment length po1ymorphism，RFLP)進行驗證比較。 結果：用mtDNA高變區(qū)I(hypervariable segment I，HVS I)序列分析結合編碼區(qū)特異性變異熒光標記

8、寡核苷酸探針驗證的方法，對70例健康志愿者進行了mtDNA單倍型類群分型。對于分型結果屬于mtDNA單倍型類群A、D、M7和M9的樣本，用RFL，P對相應特異性酶切位點進行檢測，A樣本出現(xiàn)了特征性的2個DNA片段：290bp和257bp，D型樣本出現(xiàn)了特征性的2個DNA片段：312bp和284bp，M7型樣本出現(xiàn)了特征型的2個DNA片段：361bp和47bp，M7型樣本的限制性酶切片段中含有特征性的DNA片段：76bp和36bp。RFL

9、P mtDNA單倍型類群的分型結果與序列分析和寡核苷酸探針分型的結果完全一致。 結論：mtDNA HVSI序列分析結合編碼區(qū)特征性變異驗證的分型策略是一兼顧敏感性和特異性的有效分型思路。熒光標記的寡核苷酸探針是檢測mtDNA編碼區(qū)特征性單核苷酸突變的簡捷方法，敏感性和特異性好，適用于大樣本研究。 第二部分： 研究目的：探討漢族人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R與重度膿毒血癥的發(fā)病率之間的相關性。 材料

10、和方法：病例組來自2006年6月～11月在浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院重癥監(jiān)護室(Intensive care unit，ICU)，急診重癥監(jiān)護室(Emergency intensive care unit，EICU)就診并符合重度膿毒血癥診斷的181例患者。健康對照組選擇來自浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院體檢中心體檢的健康志愿者570例。采用mtDNA HVS I序列分析結合編碼區(qū)序列特征性變異驗證的方法對研究對象的mtDNA單倍型類群進行

11、確定。 結果：分型結果顯示：東亞人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R在健康對照組的分布率分別為：47.7％、48.5％、37％，在重度膿毒血癥病例組中的分布率分別為：47％、50.8％、36.5％。X2分析的結果顯示，mtDNA單倍型類群在病例組和健康對照組中的分布率沒有明顯差異。在重度膿毒血癥病例組中，mtDNA單倍型類群R的患者，其入組第一天的最高體溫要明顯高于非R型的個體(37.88±0.129℃VS37.54±0.10

12、6℃，P=0.044)。 結論：漢族人群主要mtDNA單倍型類群M、N、R與重度膿血癥的發(fā)病率無明顯相關性。重度膿毒血癥急性期，mtDNA單倍型類群R的患者相較于非R的個體具有較高的體溫。 第三部分： 研究目的：分析漢族人群中mtDNA單倍型類群R與重度膿毒血癥預后的相關性。 材料和方法：病例組和健康對照組同第二部分。對患者進行追蹤隨訪，記錄一般信息和基本臨床資料。進行入組24小時的APACHE II(A

13、cute physiology and chronic health evaluation)評分和SOFA(Sepsis-related organ failure assessment)評分，之后每天進行SOFA評分，自至患者死亡或生存至第180天。采用先單因素分析，再多因素分析的統(tǒng)計原則，對可能的影響預后的臨床指標以及mtDNA單倍型類群與重度膿毒血癥患者的預后進行相關性分析，并以95％可信區(qū)間(Confidence interva

14、l，CI)的OR(Odds ratios)值來估計獨立變量與應變量的相關性。 結果：對生存組與死亡組的臨床資料進行比較發(fā)現(xiàn)，相較與死亡組，生存組患者平均年齡較低，合并慢性疾病狀況少，入組24小時的APACFIE II評分和SOFA評分低，胸腔感染的發(fā)生率低。X2分析顯示，mtDNA單倍型類群R患者的180天生存率為68.2％，明顯高于其他mtDNA單倍型類群(p=0.006)。Kaplan-Meier生存分析顯示mtDNA單倍型

15、類群R患者180天生存預后要明顯高于非R型的患者(p=0.0063)。mtDNA單倍型類群R患者組的基本臨床狀況，如年齡、有無合并慢性疾病、感染部位、入組24小時的APACHEII評分和SOFA評分等，于非R型患者組相比，未發(fā)現(xiàn)明顯差異。選取平均年齡、慢性病合并情況、感染部位、入組24小時的APACHE II評分和SOFA評分和單倍型類群為變量，進行多因素Logistic回歸分析顯示mtDNA單倍型類群R是影響重度膿毒血癥患者預后的獨立

16、因素，提示較高的生存率(OR 4.543，95％CI 1.903-10.844，p=0.001)。進一步分析還發(fā)現(xiàn)在病例組中必需進行輔助通氣的患者，單倍型類群為R的個體，其輔助通氣的最終脫機率要明顯高于非R型的個體(p=0.042)。多因素Logistic回歸分析mtDNA單倍型類群R是影響重度膿毒血癥患者輔助通氣脫機率的獨立因素，提示較高的脫機率(OR 9.315，95％CI 3.014-27.684，p<0.001)。 結論