西南地區(qū)稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈和吡唑醚菌酯的抗性監(jiān)測(cè)及抗性機(jī)理.pdf

1、稻瘟病(Rice blast)是危害水稻最重要的病害之一，給我國(guó)西南地區(qū)每年的水稻生產(chǎn)造成巨大的損失。目前化學(xué)防治仍是防治水稻稻瘟病的主要方式，然而長(zhǎng)期廣泛的使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。本研究在2013-2014年間通過(guò)對(duì)貴川渝18個(gè)區(qū)縣水稻稻瘟病采樣，共分離獲得了902株稻瘟病菌(Magnaporthe grisea(Hebert) Barr)。通過(guò)監(jiān)測(cè)采樣地區(qū)稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈和吡唑醚菌酯的抗性，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)出現(xiàn)了稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈(I

2、soprothiolane)的低抗性菌株。室內(nèi)人工誘導(dǎo)篩選，成功的獲得了稻瘟病菌對(duì)吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)的高抗性突變體，并對(duì)突變體的主要生物學(xué)特性、抗性機(jī)理以及交互抗性進(jìn)行研究。
　　1.稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的敏感性基線及抗藥性監(jiān)測(cè):采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定2013年分離自川渝地區(qū)100個(gè)稻瘟病菌野生單孢菌株對(duì)稻瘟靈的敏感性，結(jié)果表明其EC50值在0.8746-8.1430μg/mL之間，最不敏感菌株的EC50是最敏

3、感的9.3倍，不同敏感性的菌株分布頻率呈連續(xù)的單峰曲線分布，平均EC50值為3.0764±1.5909μg/mL，最低抑制濃度（Minimal inhibitionconcentration，MIC）≤45μg/mL。根據(jù)以上研究結(jié)果，確定以3.0764±1.5909μg/mL作為西南地區(qū)稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的敏感性基線;確定以50μg/mL作為稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的抗藥性監(jiān)測(cè)區(qū)分劑量，并以此劑量監(jiān)測(cè)各地稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的抗性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株來(lái)自

4、重慶市涪陵區(qū)龍?zhí)舵?zhèn)壽壩村的稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈有低抗性，經(jīng)測(cè)定其抗性指數(shù)為3.13。
　　2.稻瘟病菌稻瘟靈室內(nèi)抗性突變體的遺傳穩(wěn)定性:通過(guò)室內(nèi)稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌藥劑馴化，獲得了5個(gè)中抗突變體和1個(gè)高抗突變體。測(cè)定這些突變體在無(wú)藥劑選擇壓力培養(yǎng)8代后對(duì)藥劑的敏感性，結(jié)果它們對(duì)稻瘟靈均變?yōu)槊舾?，表明它們的抗藥性不能穩(wěn)定遺傳。由于未能獲得穩(wěn)定抗稻瘟靈的稻瘟病菌突變體，所以未能進(jìn)一步研究分析稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的抗藥性機(jī)理。
　　3.稻瘟病

5、菌對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性基線及抗藥性監(jiān)測(cè):采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了2013年分離自川渝地區(qū)100個(gè)稻瘟病菌野生單孢菌株對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性，結(jié)果表明其EC50值在0.00313-0.02448μg/mL之間，最不敏感菌株的EC50是最敏感的7.8倍，不同敏感性的菌株分布頻率呈連續(xù)的單峰曲線分布，平均EC50值為0.00917±0.00385μg/mL，MIC≤0.8μg/mL。根據(jù)以上研究結(jié)果，確定以0.00917±0.00385μg/m

6、L作為西南地區(qū)稻瘟病菌對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性基線;確定以1.0μg/mL作為稻瘟病菌對(duì)吡唑醚菌酯的抗藥性監(jiān)測(cè)區(qū)分劑量，并以此劑量監(jiān)測(cè)各地稻瘟病菌對(duì)吡唑醚菌酯的抗性，結(jié)果表明所測(cè)菌株均為敏感菌株，未發(fā)現(xiàn)田間抗性菌株。
　　4.稻瘟病菌對(duì)吡唑醚菌酯抗性突變體及主要生物學(xué)特性:通過(guò)室內(nèi)吡唑醚菌酯對(duì)稻瘟病菌藥劑馴化，獲得了3個(gè)中抗突變體和1個(gè)高抗突變體。將這些菌株在無(wú)藥劑選擇壓力下連續(xù)培養(yǎng)8代后，抗性突變體PYC40-Mut對(duì)吡唑醚菌酯的抗

7、性水平依然保持在高抗水平，表明其抗藥性可以穩(wěn)定地遺傳;另3個(gè)突變體的抗藥性水平下降為敏感，因此以PYC40-Mut作為后續(xù)研究材料。PYC40-Mut敏感性測(cè)定表明，其對(duì)吡唑醚菌酯的EC50值為2.7383μg/mL，抗性倍數(shù)為370倍，為高抗藥性突變體。PYC40-Mut生物學(xué)特性測(cè)試結(jié)果表明，其單孢后代對(duì)吡唑醚菌酯敏感性與親本菌株無(wú)顯著性差異;離體適合度、活體適合度和綜合適合度與親本菌株相比均顯著下降。
　　5.稻瘟菌對(duì)吡唑醚

8、菌酯的抗性機(jī)理:用CTAB法提取PYC40-Mut和其親本菌株P(guān)YC40的基因組DNA，以引物Pgcytb-F1（5'-AGTCCTAGTGTAATGGAAGC-3'）和Pgcytb-R1（5'-ATCTTCAACGTGTTTAGCACC-3'）對(duì)Cyt b基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了PYC40-Mut和PYC40菌株Cyt b基因的部分堿基序列，測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)PYC40-Mut有一處堿基位點(diǎn)發(fā)生改變，其Cyt b基因428位堿基由鳥嘌

9、呤(G)突變成為胞嘧啶(C)，導(dǎo)致其相應(yīng)的143位氨基酸由甘氨酸(G)突變?yōu)楸彼?A)，這可能是PYC40-Mut菌株對(duì)吡唑醚菌酯產(chǎn)生抗性的機(jī)理。
　　6.交互抗性:稻瘟病菌吡唑醚菌酯抗性菌株平板交互抗性測(cè)定結(jié)果表明，吡唑醚菌酯與甲氧基丙烯酸酯類（Strobilurins）殺菌劑醚菌酯（Kresoxim-methy）和嘧菌酯(Azoxystrobin)之間存在正交互抗性，而與甾醇類的苯醚甲環(huán)唑(Difenoeonazole)、三

10、唑類的戊唑醇(Tebuconazloe)、黑色素合成抑制劑類的三環(huán)唑(Tricyclazole)和有機(jī)雜環(huán)類的稻瘟靈之間無(wú)交互抗性。
　　以上研究結(jié)果表明，本研究在抗藥性監(jiān)測(cè)過(guò)程中，雖然發(fā)現(xiàn)了對(duì)稻瘟靈的抗性菌株，但其抗性程度較低，抗性頻率也不高，因此稻瘟靈依舊可以作為我國(guó)西南地區(qū)防治稻瘟病的藥劑，但在出現(xiàn)抗性菌株的地區(qū)應(yīng)該將稻瘟靈和其它藥劑的輪換使用。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑屬于抗藥性產(chǎn)生的高風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑，本研究通過(guò)室藥劑馴化成功的獲