西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的抗性監(jiān)測及抗性分子機(jī)理研究.pdf

1、稻瘟病是影響水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)的重要病害，目前對于稻瘟病的防治依然以化學(xué)防治為主，西南地區(qū)是我國稻瘟病的常發(fā)區(qū)，防治藥劑主要有三環(huán)唑、稻瘟靈等，藥劑的長期使用所帶來的抗藥性問題給稻瘟病的防治帶來了重大隱患。戊唑醇是廣譜性的內(nèi)吸性DMIs類殺菌劑，對于多種真菌的防治都有良好的效果，在我國很多地區(qū)開始用于防治稻瘟病，但在西南地區(qū)還未廣泛使用。本研究擬通過對西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的敏感性基線的建立，田間抗性監(jiān)測，抗性菌株的生物學(xué)特性以及抗性

2、分子機(jī)理等方面的研究，為該藥劑在本地區(qū)用于防治稻瘟病提供理論指導(dǎo)。
　　1.西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的敏感基線
　　隨機(jī)選取分離自西南地區(qū)的稻瘟病菌野生菌株150株，通過菌絲生長速率法測定了它們對戊唑醇的敏感性，根據(jù)EC50值的分布建立了稻瘟病菌對戊唑醇的敏感基線。結(jié)果表明，EC50值的區(qū)間為0.0475~0.5996μg/mL，平均值為0.2154±0.1497μg/mL，其中最不敏感菌株的EC50值是最敏感菌株的12.6

3、2倍。敏感性頻率分布呈連續(xù)性單峰曲線，因此本研究以供試菌株的EC50平均值作為西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的敏感性基線。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，分離自不同地區(qū)的稻瘟病菌對戊唑醇的敏感性呈現(xiàn)顯著性差異：分離自四川綿陽的菌株最敏感，其平均EC50值為0.0872±0.0461μg/mL；貴州六枝特區(qū)和四川宣漢的菌株最不敏感，平均EC50值分別為0.4570±0.0855μg/mL和0.4436±0.1289μg/mL；四川綿陽的菌株與四川宣漢的菌株對戊唑醇的

4、敏感性相差5.09倍。
　　2.西南地區(qū)稻瘟病菌對戊唑醇的田間抗性分布
　　使用菌絲生長速率法測定了隨機(jī)選取的30株稻瘟病菌對戊唑醇的MIC值，并以此作為抗性監(jiān)測的區(qū)分劑量對所有采集分離的菌株進(jìn)行抗性監(jiān)測。MIC值分布在1.5～4.0μg/mL之間，最大的MIC值為4.0μg/mL。因此，本研究以4.0μg/mL作為稻瘟病菌對戊唑醇的敏感菌株和抗性菌株的區(qū)分劑量。對分離自西南地區(qū)的1014株稻瘟病菌的監(jiān)測結(jié)果表明，本地區(qū)稻瘟

5、病菌對于戊唑醇主要表現(xiàn)為敏感，僅在重慶涪陵和四川宣漢各有一株病菌表現(xiàn)出低抗。雖然西南地區(qū)已經(jīng)有對戊唑醇產(chǎn)生抗藥性的菌株出現(xiàn)，但是抗性較低且頻率較低，四川和重慶的的抗性菌株發(fā)生頻率分別為0.33％和0.21%，因此在制定了合理的與其他藥劑混用的策略下可以將戊唑醇作為西南地區(qū)進(jìn)行稻瘟病防治的藥劑，但是要做好田間抗性的實(shí)時(shí)監(jiān)測工作，以延長藥劑的使用壽命。
　　3.稻瘟病菌戊唑醇室內(nèi)抗性菌株的生物學(xué)特性
　　通過稻瘟病菌野生菌株進(jìn)行

6、室內(nèi)戊唑醇藥劑馴化得到兩株中抗菌株 PWS2-1和PMY30-1，EC50值分別為2.5736μg/mL和1.7689μg/mL，抗性倍數(shù)為25.46和31.26。將其在無藥的平板上連續(xù)培養(yǎng)8代以后，仍然表現(xiàn)為中抗，因此說明其抗性可以穩(wěn)定遺傳。對它們及其親本菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，抗性菌株的生長速率顯著低于其親本菌株，產(chǎn)孢量也低于其親本菌株，PWS2-1與PMY30-1的離體適合度分別為0.76和0.04，因此抗性菌株的離體

7、適合度低于其親本菌株。同時(shí)在水稻葉片上進(jìn)行了孢子懸浮液的接種測定其致病性，結(jié)果表明，敏感菌株P(guān)WS2和PMY30的病斑長度分別為6.5±1.00mm和6.9±2.32mm，而抗性菌株P(guān)WS2-1和PMY30-1的病斑長度分別為3.6±0.52mm和5.0±0.90mm，說明抗性菌株的致病性顯著低于其親本菌株。測定其在不同的溫度及pH值條件下的生長速率，結(jié)果表明，抗性菌株對溫度和pH值的適應(yīng)性與其親本菌株基本一致。而對于不同作用機(jī)制的殺菌

8、劑進(jìn)行敏感性測定的結(jié)果表明，戊唑醇抗性菌株對于DMIs類殺菌劑烯唑醇、苯醚甲環(huán)唑存在正交互抗性，對于稻瘟靈、三環(huán)唑、稻瘟酰胺、吡唑醚菌酯則沒有表現(xiàn)出交互抗性。
　　4.稻瘟病菌對戊唑醇抗性的分子機(jī)理
　　用 CTAB法提取病原菌的DNA，使用特異性引物Cyp51-ⅠF:5’-ATGGGC CTTCTACAGGACACC-3’/Cyp51-ⅠR:5’-TTAGCGCCTCTCC CAGTAAATT-3’；和Cyp51-ⅡF:5

9、’-CTACGCAGTCTTCGGGCT-3’/Cyp51-ⅡR:5’-ATGGCTTTCTT CTTCCC-3’分別對室內(nèi)抗性菌株P(guān)WS2-1和PMY30-1及其親本菌株P(guān)WS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因進(jìn)行克隆，測序，比對，探尋抗性菌株的突變位點(diǎn)。結(jié)果表明，抗性菌株各自的突變位點(diǎn)并不一致：菌株P(guān)WS2-1的cyp51-Ⅰ基因未發(fā)生突變，cyp51-Ⅱ基因具有3個(gè)突變位點(diǎn)，分別為R163C、F253I和V257A

10、；菌株P(guān)MY30-1的cyp51-Ⅰ基因具有1個(gè)突變位點(diǎn)，為R23G，而cyp51-Ⅱ基因未發(fā)生突變。同時(shí)對于抗性菌株P(guān)WS2-1和PMY30-1及其親本菌株P(guān)WS2和PMY30的cyp51-Ⅰ和cyp51-Ⅱ基因的表達(dá)量進(jìn)行了熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，抗性菌株與其親本菌株的cyp51-Ⅰ基因的表達(dá)量的變化趨勢并不一致，抗性菌株P(guān)WS2-1的表達(dá)量較親本菌株高，而抗性菌株P(guān)MY30-1的表達(dá)量較親本菌株低；cyp51-Ⅱ基因的表達(dá)量