FAK、talin和paxillin在切應(yīng)力促EPCs分化過(guò)程中的作用.pdf

1、目的：利用切應(yīng)力加載裝置，模擬生理狀態(tài)下大動(dòng)脈系統(tǒng)所受的層流切應(yīng)力，作用于大鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，驗(yàn)證切應(yīng)力是否可以促使EPCs向內(nèi)皮分化，并檢測(cè)在此過(guò)程中局部粘著斑激酶(FAK)、踝蛋白(talin)和樁蛋白(paxillin)三個(gè)蛋白的變化情況，從而為揭示切應(yīng)力促EPCs分化的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供一定的依據(jù)，并為完善受損血管內(nèi)皮修復(fù)的具體機(jī)制提供一定的參考。
　　 方法：1、梯度密度離心法從大鼠骨髓中分離提取單

2、個(gè)核細(xì)胞，用加有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF、堿性成纖維生長(zhǎng)因子BFGF和15％胎牛血清的M199培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，兩周后用雙吞噬法鑒定是否成功培養(yǎng)出EPC，培養(yǎng)至第三代制成細(xì)胞爬片。
　　 2、將細(xì)胞爬片分為切應(yīng)力加載組和靜止組，利用切應(yīng)力加載裝置，模擬生理狀態(tài)下大動(dòng)脈系統(tǒng)所受的層流切應(yīng)力大小，給予切應(yīng)力加載組細(xì)胞爬片12 dyne/cm2的力學(xué)負(fù)荷。
　　 3、分別提取切應(yīng)力加載3h、6h、12h組和靜止組細(xì)胞爬片的RNA

3、，用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞分化標(biāo)記分子vWF和CD31基因的表達(dá)情況。
　　 4、取切應(yīng)力加載組和靜止組的細(xì)胞爬片，用細(xì)胞免疫熒光(IF)觀察FAK、talin和paxillin三個(gè)蛋白的表達(dá)位置的變化；用Western Blot檢測(cè)上述三個(gè)蛋白表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果：1、雙吞噬法雙陽(yáng)性提示成功培養(yǎng)出大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)。
　　 2、切應(yīng)力(12 dyne/cm2)作用于EPCs后，顯著增加內(nèi)

4、皮細(xì)胞分化標(biāo)記分子vWF和CD31基因的表達(dá)，與靜止組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、細(xì)胞免疫熒光(IF)結(jié)果顯示，靜止組中FAK、talin和paxillin三個(gè)蛋白主要位于胞漿中，表達(dá)量豐富，并且都在細(xì)胞的核周比較聚集；切應(yīng)力作用3h以后，talin和paxillin蛋白的熒光強(qiáng)度變?nèi)酰鳩AK的位置從核周圍沿著切應(yīng)力作用方向聚集成束狀延伸至胞膜。
　　 4、切應(yīng)力加載3h組和靜止組的Western